第一篇：解读个体化医学检测与实验室自建试剂方法
解读个体化医学检测与实验室自建试剂方法 李金明
个体化医学（personalized medicine）通俗顾讲，就是疾病的治疗“因人而异”的医学，确切地说，是根据每个患者的个体特征制定相应的治疗策略的医学，但并不意味着对每个病人都准备一套药物或设立一套治疗设备，而是根据患者对特定疾病的易感性以及对特定治疗的应答程度进行分类治疗，使得预防或治疗性的干预措施能集中于确定会受益的人群，从而为那些不会受益的人群节省医疗开支并减少药物的副反应。
个体化医学检测则是为疾病的个体化治疗决策服务的，也就是通过实验室检测，确定患者是否会对特定的治疗产生有效的应答。2003年人类基因组计划基本完成后，进入到后基因组时代，功能基因组的研究，揭示了占人类基因组约1%的单核苷酸多态性（SNPs）不但决定个体的“高矮胖瘦”等外在特征，也决定了个体对外在刺激应对能力以及进入机体的化学物质如药物等的代谢能力，于是产生了药物基因组学。
各种细胞信号传导通路的深入基出研究，产生了疾病的靶向治疗概念，各种靶向治疗药物研发的跟进，使得靶向治疗成为现实，但靶向治疗的有效性又与相应基因结构的改变、表达以及代谢密切相关。因此，进行相应基因及结构改变以及基因表达等的检测是相关检测的基础，在分子水平上做出临床诊断，从而增加诊断的准确性并根据患者的遗传特征选择合适的治疗方法，这就是个体化医学检测，其意义通俗地讲，就是决定特定的治疗药物或方法是否能用或用多用少。
个体化医学检测目前国内既有经国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的商品试剂，也有实验室自建试剂方法（laboratory developed tests，LDTs），但实验室对LDTs、性能验证（verification）和性能确认（validation）等概念通常比较模糊，如何去做性能验证和性能确认，以及在什么情况下做，性能验证的合格判决断标准等，也不清楚。本文特就上述方面谈一点个人的理解和思考。
一、国内个体化医学检测现状及特点
近几年来，国内医疗机构临床实验室已开展了一些涉及肿瘤靶向治疗基因突变和药物代谢基因多态性检测等个体化医学检测项目，并呈快速增加之势，有以下几个方面的特点。
1、采用的技术平台多
以聚合酶链反应（PCR）为基础的技术为主，如实时荧光PCR方法（包括扩增阻碍突变系统法[Amplification Refractory Mutation System，ARMS]、PCR-高分辨溶点曲线分析[HRM]等）、PCR-杂交法（如膜上、芯片[基因芯片]、乳胶颗粒[Luminex]）、PCR-质谱、PCR-Sanger测序、PCR-焦磷酸测序、PCR-新一代高通量测序等，其它较为常用的还有荧光原位杂交（FISH）和免疫组化等。
2、涉及的临床科室多
目前国内开展个体化医学检测的临床实验室所涉及的科室非常多，因为个体化药物治疗研究进展日新月异，可考虑采用基因检测来决定药物使用的药物名单越拉越长，几乎涉及所有临床科室，只要相应科室的主任有相应知识和意识，也有实验室，就有可能去开展相关检验项目。因此，国内目前开展个体化医学检测项目的实验室大部分在非检验科的其它科室或临床科室的研究实验室，如病理科、药剂科、妇产科、肿瘤科、心胸外科、眼科、耳鼻喉科、转化医学中心、中心实验室、医疗机构研究所和医学检验所等。
3、自配试剂多
个体化医学检测尽管已有一些国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的检测试剂，涉及约30余个检验项目，但仍有许多实验室所使用的试剂为自配试剂或方法为自建方法，即LDTs，如几乎所有PCR-Sanger测序、PCR-限制性长度片段多态性分析（RFLP）、PCR-质谱和PCR-高通量测序等。此外，有许多实验室对商品试剂盒的组份及操作进行了改变，一旦出现这种改变，所用试剂即应被视为LDTs。还有，如果使用无证商品试剂，也属于LDTs。所以LDTs目前应可以分为三类：（1）实验室通过购买试剂盒原材料如引物、探针、扩增缓冲液、酶等，配制的自用试剂；
（2）实验室购买的是经过批准的商品试剂，但对试剂盒组份或操作过程进行了改变；
（3）实验室购买的是未经过批准的无证商品试剂。
二、国内外对体外诊断产品和LDTs管理
在北美和欧洲，涉及人类基因的个体化医学检测，极少有经过批准的商品试剂盒或检测系数统，绝大部分都是由医疗机构通过使用LDTs来完成的。在美国，1976年的联邦食品、药品和化妆品医学产品法案修正案（The 1976 Medical Device Amendments to the Federal Food，Drug and Cosmetic Act，FD&CA)授权美国食品药品监督管理局（FDA）监管包括体外诊断产品（in vitro diagnostic devices，IVDs）在内的医学产品。IVDs定义为用于疾病诊断或包括为治疗或预防疾病确定患者健康状态的其它目的的试剂、仪器和系统，为作为商品销售。根据其对患者的风险评估分为三类，I类为低风险，用于患者前，不需要评估或批准；Ⅱ类为中度风险，而进行一般和特定的控制，常需通过进入市场前的告知方式或者510（K）过程由FDA进行评估；Ⅲ类为高风险，则需要进入市场前的批准（premarket approval，PMA）程序。一般的药物遗传检测属于Ⅱ类。加拿大则将IVDs的风险分为四级，遗传检测归为Ⅲ类，即对公众健康有中等风险或对个体有高风险。欧盟则制定了“体外诊断医学产品指令”（the In Vitro Diagnostic Medical Devices Directive[Council Directive 98/79/EC]），作为欧盟的IVDs监管的要求，设定了最低安全、质量和性能标准，但具体评价由成员国的监管机构进行，一旦通过一个国家的批准，则全欧盟成员国通行有效。在国内，IVDs的监管由国家食品药品监督管理总局（CFDA）负责，管理法规是以国务院令形式发布《医疗器械监督管理条例》，同样，IVDs按低、中和高风险分为三类，第一类实行产品备案管理，第二类、第三类实行产品注册管理。二类由省级药监部门负责注册，三类由CFDA负责注册。
相对于IVDs，临床实验室为疾病诊断和治疗进行实验室检测及报告结果，在美国应遵循“1988年的临床实验室改进修正案（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA)，具体由美国医疗保险和医疗补助中心（the Centers for Medicare& Medicaid Services，CMS）监管，遵循CLIA要求对实验室检查、认证和认可由CMS或独立的授权机构如病理学家协会（the College of American Pathologists，CAP）负责。CLIA关注的是检测过程的准确性和可靠性，以及质量控制、室间质量评价（能力验证）、实验室检测人员的证书、报告结果的要求和标准操作程序（SOP）文件，实验室负责人起着核心作用。作为CLIA的一部分，FDA将实验室检测根据其复杂程度分为豁免、中度和高度复杂三类，CLIA再针对这三类检测提出不同的管理要求。CLIA允许临床实验室修改FDA批准的诊断产品以及研发其自己实验室的检测，亦即LDTs。在CLIA规则下的定期检查确保LDTs遵循必要的程序，并且LDTs检测只能是在执业医生、实验室科学家、遗传学家和分子病理学家等实验室专家的指导下进行。在美国绝大部分的基因遗传相关检测均采用LDTs，欧洲亦如此，但欧洲LDTs只适用于政府的公共医疗机构实验室，可免于IVD Directive监管，只能在自己实验室使用，如要提供给其它机构实验室，则需要走监管程序。国内针对LDTs在2000年发布的《医疗器械监督管理条例》（国务院令第276号）中的第十条规定，医疗机构根据本单位的临床需要，可以研制医疗器械，在执业医师指导下在本单位使用。2014年新发布的《医疗器械监督管理条例》（国务院令第650号）删去了这一条，但并没有规定不允许自制医疗器械。
近些年来，在美国一些商业实验室开展了直接针对消费者的检测项目（direct to consumer，DTC），主要是一些疾病风险预测的项目，均为LDTs。因为其意义的不明确和结果解读的问题，对被检者有可能造成不可预知的困惑或伤害。例如，美国好莱坞著名女演员茱莉2013年5月14日在美国《纽约时报》发表了“My Medical Choice（我的医疗选择）”一文，她表示自己由于携带乳腺癌1号基因（BRCA1），已经接受预防性的双侧乳腺切除手术，以降低罹癌风险。据茱莉介绍，自己的母亲曾经与癌症作斗争了近十年，于56岁时去世。由于妈妈给她遗传了BRCA1基因，因此患乳腺癌和卵巢癌的几率比较高，分别是87%和50%。因此，美国FDA试图对LDTs进行有限的监管，2014年7月再次向美国国会提交议案，在这份提案中FDA计划按照LDT类型分为I级低风险；II级中度风险，III级高风险，分别对应告知（reporting）、注册（registration）、510(k)认证等监管要求。对于罕见疾病，以及有巨大的临床需求，且安全性被证实的诊断技术，FDA把它划为I级低风险，仍然由CMS监管。但也有众多学者反对，提出FDA是管诊断产品的，而临床实验室研发LDTs提供的只是一种医学服务，并非产品。但强调LDTs在临床应用前，应有严格的性能确认程序，使用中有严格的质量控制和使用情况监控。国内LDTs如何能有效地为临床服务，如何进行管控是值得业界思考的一个问题。
三、性能验证和性能确认
为保证检验质量，临床实验室在正式开展日常检测之前，应对其检测试剂方法或系统进行性能验证（verification）或性能确认（validation）。性能验证在广义上的概念是指通过提供客观证据证明特定的要求得到满足。而美国的CLIA中的性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。说明性能验证特指针对经批准的商品试剂或检测系统，其所要验证的是在特定的实验室条件（环境、人员、标准操作程序）下的检测性能指标是否与试剂盒说明书上所标示的是一致的。因此，对各项检测性能指标如精密度、准确度、分析敏感性等的验证是否合格的判断标准应以试剂盒说明书为准，如何进行性能验证也可按试剂盒说明书中相应性能指标确立时的方法进行，但可以适当简化。而性能确认（validation），美国FDA和国际标准化组织（ISO）均将其定义为，通过检查和提供客观证据证明，对一特定预期用途（intended use）的要求始终能得到满足。性能验证和性能确认在美国FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”。比如说，某实验室自制了一个表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）18~21号外显子基因突变检测试剂，也就是其预期用途是检测上述基因突变，性能确认就是通过实验所提供的客观证据证明该试剂是否能正确的且可重复地检测到相应基因突变。世界卫生组织（WHO）则将“性能确认”定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程）。因此，“性能确认”可用来指在测定方法研发时，建立的分析性能特征。由上述可见，“性能验证”要验证的是商品试剂盒说明书中所列出的性能验指标如精密度（重复性）、准确度、测定范围、线性范围（定量）、分析敏感性、分析特异性、抗干扰能力等是否在特定实验室条件下是否可以复现。而“性能确认”为LDTs建立上述性能指标，从而证明其能满足相应的应用目的。
第二篇：分子生物学实验室常用试剂的配制方法
一.常用贮液与溶液
1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。
10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇
至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。
8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。
1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。
3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。
0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。
1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。
1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。
25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。
1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。
100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹
或贮存于-20℃。
20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）
5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。
10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。
10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。
2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。
100％三氯乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制）
2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。
100×Denhardt试剂（Denhardt's regent）
成分及终浓度
配制100ml溶液各成分的用量
2%聚蔗糖（Ficoll，400型）
2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）
2%BSA（组分V）
水
2g 2g 2g
加水至总体积为100ml
依照上表称取各组分，溶于水中定容。过滤除菌及杂质，分装成小份于-20℃贮存。
10×标准DNA连接酶缓冲液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端连接）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分的用量
0.5mol/L Tris-HCl 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT 2mmol/L ATP
5mmol/L 盐酸亚精胺（可选）
0.5mg/ml BSA（组分V）（可选）
水
5ml 1mol/L 贮液
1ml 1mol/L 贮液
1ml 1mol/L 贮液
200ul 100 mmol/L 贮液
50ul 1 mmol/L 贮液
0.5ml 10 mg/mL 贮液
2.25ml
将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃。
mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions）
可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。
10mmol/L dNTP混合液
成分及终浓度
配制20ul溶液各成分的用量
10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP 水
2ul 100 mmol/L dATP 贮液
2ul 100 mmol/L dCTP 贮液
2ul 100 mmol/L dGTP 贮液
2ul 100 mmol/L dTTP 贮液
12ul
20％PEG 8000/2.5M NaCl
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分的用量
质量浓度为20％聚乙二醇
2.5mol/L 氯化钠
水 20g
50ml 5 mol/L 氯化钠 或 14.6g 固体氯化钠
补足100ml
加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中，加水至终体积100ml，用磁力搅拌器搅拌溶解。
20×SSC
成分及终浓度
配制1L溶液各成分的用量
300mmol/L 柠檬酸三钠（二水）
3mol/L 氯化钠
水
88.2g 175.3g 补足1L
溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10N NaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。
DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水
加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的体积分数为0.1％。在37℃温浴至少12h，然后在15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。
甲酰胺（deionized formamide）
直接购买或加Dowex XG8 混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中，用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，可去除甲酰胺中的离子。经Whatman 1号滤纸过滤除去树脂后分成小份，充氮气于-80℃贮存（防止氧化）。
磷酸缓冲液（phosphate buffer）
按照下表所给定的体积，混合1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L 磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。配制1 mol/L 的磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）贮液：溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:溶解142g于足量水中使终体积为1L。
1mol/L 磷酸二氢钠（ml）
1mol/L 磷酸氢二钠（ml）
最终pH值
877 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 123 150 185 225 265 315 375 435 490 550 610 670 720 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2
TE（用于悬浮和贮存DNA）
成分及终浓度
配制100ml溶液各成分的用量
10mmol/L Tris－HCl 1mmol/L EDTA 水
1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃）
200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
98.8ml
Tris缓冲液（Tris-HCl buffer）
将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。
浓盐酸的体积（ml）
pH
8.6 14 21 28.5 38 46 56 66 71.3 76 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2
二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
电泳缓冲液
50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
成分及终浓度
配制1L溶液各成分的用量
2mol/L Tris碱
1mol/L 乙酸
mmol/L EDTA 水
242g
57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）
200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
补足1L
5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
成分及终浓度
配制1L溶液各成分的用量
445 mmol/L Tris碱
445 mmol/L 硼酸盐mmol/L EDTA 水
54g 27.5g 硼酸 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
补足1L
染料
1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。
凝胶上样液（gel loading solutions）
6×碱性凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.3 N 氢氧化钠mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型）
0.15％溴甲酚绿
0.25％二甲苯青FF 水
300ul 10N 氢氧化钠
120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
1.8g 15mg 25mg 补足到10ml
6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型）
水
1.5ml 1％溴酚蓝
1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
1.5g 补足到10ml
6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型）
水
2.5ml 1％溴酚蓝 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g 补足到10ml
6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油
水
1.5ml 1％溴酚蓝
1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
3ml 3.9ml
6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.15％溴酚蓝
0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖
水
1.5ml 1％溴酚蓝
1.5ml 1％二甲苯青FF
100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
4g
补足到10ml
10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分用量
0.2％溴酚蓝
0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油
水
20mg 20mg
4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ul 10％ SDS 5ml 补足到10ml
三.常用培养基
LB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨
10g
酵母提取物
5g
氯化钠
10g
如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨
20g
酵母提取物
5g
氯化钠 0.5g mol/L 氯化钾
2.5ml
用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。
SOC培养基
成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。
TB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨
12g
酵母提取物
24g
甘油
4ml
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。
2×YT培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨
16g
酵母提取物
10g
氯化钠
4ml
如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
YPD培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨
20g
酵母提取物
10g
葡萄糖
20g
用水补足体积为1L后，高压灭菌。建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。
四.常用抗生素
氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
链霉素（streptomycin）（50mg/ml）
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
四环素（tetracyyline）（10mg/ml）
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
第三篇：【引用】高中生物实验常用的试剂和检测方法
【引用】高中生物实验常用的试剂和检测方法
(1)化学物质的检测方法： ①淀粉碘液——
②还原糖、班氏试剂——斐林试剂
③CO2——Ca(OH)2溶液或酸碱指示剂或溴麝香草酚蓝溶液 ④O2——余烬复燃
⑤蛋白质——双缩脲试剂
⑥染色体、醋酸洋红溶液——龙胆紫 ⑦DNA——二苯胺试剂 ⑧脂肪苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液—— ⑨酒精——酸化的重铬酸钾溶液
(2)实验结果的显示方法：
①光合速率——O2释放量或CO2吸收量或淀粉产生量 ②呼吸速率——O2吸收量或CO2释放量或淀粉减少量 ③原子途径——放射性同位素示踪法 ④细胞液浓度大小——质壁分离 ⑤细胞是否死亡——质壁分离
⑥甲状腺激素作用——动物耗氧量，发育速度等 ⑦生长激素作用——生长速度(体重变化，身高变化)⑧胰岛素作用——动物活动状态
(3)实验条件的控制方法：
①增加水中氧气——泵入空气或吹气或放入绿色植物 ②减少水中氧气——容器密封或油膜覆盖或用凉开水 ③除去容器中CO2——NaOH溶液
④除去叶片中原有淀粉——置于黑暗环境 ⑤除去叶片中叶绿素隔水加热——酒精
⑥除去光合作用对呼吸作用的干扰——给植株遮光 ⑦如何得到单色光——棱镜色散或彩色薄膜滤光 ⑧线粒体提取——细胞匀浆离心
⑾灭菌方法——微生物培养的关键在于灭菌，对不同材料,灭菌方法不同：培养基用高压蒸气灭菌；接种环用火焰灼烧灭菌；双手用肥皂洗净，擦干后用75％酒精消毒；整个接种过程都在实验室无菌区进行。
(4)实验中控制温度的方法： ①还原糖鉴定：水浴煮沸加热 ②酶促反应：水浴保温 ③用酒精溶解叶中的叶绿素：酒精要隔水加热 ④DNA的鉴定：水浴煮沸加热
⑤细胞和组织培养以及微生物培养：恒温培养 2．斐林试剂、班氏试剂与尿糖试纸
这三种物质均可用来检验含醛基的有机物的存在，在医学上用来检验糖尿病，其原理均是利用了Cu2+的氧化性把醛基氧化，但成分略有不同：
斐林试剂：即硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠组成的蓝色混合溶液。分为斐林试剂A和斐林试剂B，A为CuSO4溶液，B为氢氧化钠和酒石酸钾钠的混合溶液，使用时将A、B等体积混合即成斐林试剂。
班氏试剂：即硫酸铜、碳酸钠和柠檬酸钠组成的混合液，又叫本尼迪克特(Benedict)试剂，它与醛反应的结果是与斐林试剂一致的，只是比斐林试剂更稳定，所以在临床化验中更常使用。
尿糖试纸：又叫硫酸铜试纸，呈白色,带蓝色斑点，用于糖尿病患者的尿糖测试。每片含硫酸铜20毫克,枸橼酸毫克,碳酸钠80毫克，氢氧化钠235毫克。尿糖试纸法快速、方便，试纸的正确使用方法为：将试纸条放在尿液中浸湿，一秒钟后取出，在一分钟内观察试纸的颜色，并与标准色板对照，根据不同的颜色来确定尿糖阳性的程度。300 3．斐林试剂和双缩脲试剂的比较
相同点：①都由NaOH溶液和CuSO4溶液构成；
②斐林试剂甲液和双缩脲试剂A都为0．1g/mLNaOH溶液。
不同点：①CuSO4溶液浓度不一样：斐林试剂乙液为0．05g/mLCuSO4溶液，双缩脲试剂B为0．01g/mLCuSO4溶液。
②配制比例不一样。
③使用方法不一样：斐林试剂是甲、乙液一起混合后再使用，双缩脲试剂则是先向待鉴定材料加入A试剂摇匀后，再加入试剂B。
④鉴定的对象不一样：斐林试剂鉴定的是还原糖，双缩脲试剂鉴定的是蛋白质。⑤反应本质及颜色反应不一样。4．苏丹Ⅲ染液与苏丹Ⅳ染液的比较
都是用来鉴定脂肪。苏丹Ⅳ染液更易溶于脂肪，所以染色更深，同时要求染色时间更短。生物学中常用的试剂：
1、斐林试剂： 成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.05g/ml CuSO4（乙液）。用法：将斐林试剂甲液和乙液等体积混合，再将混合后的斐林试剂倒入待测液，水浴加热或直接加热，如待测液中存在还原糖，则呈砖红色。
2、班氏糖定性试剂：为蓝色溶液。和葡萄糖混合后沸水浴会出现砖红色沉淀。用于尿糖的测定。
3、双缩脲试剂：成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.01g/ml CuSO4（乙液）。用法：向待测液中先加入2ml甲液，摇匀，再向其中加入3~4滴乙液，摇匀。如待测中存在蛋白质，则呈现紫色。
4、苏丹Ⅲ：用法：取苏丹Ⅲ颗粒溶于95%的酒精中，摇匀。用于检测脂肪。可将脂肪染成橘黄色（被苏丹Ⅳ染成红色）。
5、二苯胺：用于鉴定DNA。DNA遇二苯胺（沸水浴）会被染成蓝色。
6、甲基绿：用于鉴定DNA。DNA遇甲基绿（常温）会被染成蓝绿色。（甲基绿使DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。）7、50%的酒精溶液：在脂肪鉴定中，用苏丹Ⅲ染液染色，再用50%的酒精溶液洗去浮色。8、75%的酒精溶液：用于杀菌消毒，75%的酒精能渗入细胞内，使蛋白质凝固变性。低于这个浓度，酒精的渗透脱水作用减弱，杀菌力不强；而高于这个浓度，则会使细菌表面蛋白质迅速脱水，凝固成膜，妨碍酒精透入，削弱杀菌能力。75％的酒精溶液常用于手术前、打针、换药、针灸前皮肤脱碘消毒以及机械消毒等。9、95%的酒精溶液：冷却的体积分数为95%的酒精可用于凝集DNA。10、15%的盐酸：和95%的酒精溶液等体积混合可用于解离根尖。
11、龙胆紫溶液：(浓度为0.01g/ml或0.02g/ml)用于染色体着色，可将染色体染成紫色，通常染色3~5分钟。（也可以用醋酸洋红染色）12、20%的肝脏、3%的过氧化氢、3.5%的氯化铁：用于比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率。（新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶）13、3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、2%的新鲜淀粉酶溶液：用于探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用实验。
14、碘液：用于鉴定淀粉的存在。遇淀粉变蓝。
15、丙酮：用于提取叶绿体中的色素。
16、层析液：（成分：20份石油醚、2份丙酮、和1份苯混合而成，也可用93号汽油）可用于色素的层析，即将色素在滤纸上分离开。
17、二氧化硅：在色素的提取的分离实验中研磨绿色叶片时加入，可使研磨充分。
18、碳酸钙：研磨绿色叶片时加入，可中和有机酸，防止在研磨时叶绿体中的色素受破坏。19、0.3g/mL的蔗糖溶液：相当于30%的蔗糖溶液，比植物细胞液的浓度大，可用于质壁分离实验。20、0.1g/mL的柠檬酸钠溶液：与鸡血混合，防凝血。
21、氯化钠溶液：①可用于溶解DNA。当氯化钠浓度为2mol/L、0.015mol/L时DNA的溶解度最高，在氯化钠浓度为0.14 mol/L时，DNA溶解度最低。②浓度为0.9%时可作为生理盐水。
第四篇：检验科试剂与校准品管理制度解读
检验科试剂与校准品管理制度 1.试剂与校准品采购与储存的管理
1.1成立试剂管理小组,协助科主任规范试剂管理过程中各个环节。并指定专人做好试剂的登记入库、出库、清点盘存、保管、报废等工作,做到账册实物相符。
1.2请购试剂必须填写请购单,科主任审查签字,然后交院采购中心统一采购。1.3各实验室组长要按实际用量,以保证检验质量和节约开支为原则,有计划地请购试剂,以免造成试剂的无故浪费。
1.4试剂进货要做到来源渠道正规、货物优质、有批准文号、生产日期及供货单位加盖红印的《经营许可证》、《生产许可证》、《注册证》复印件和法人委托书及业务员的身份证明。以上资料统一由采购中心专人登记保管。
1.5验收试剂时,须核对规格、批号、数量,批准文号。发现试剂盒破损、试剂溢出及过期试剂一律给予退回。验收人须在发票上签字,并在《试剂验收登记》上详细记录,然后将发票交采购中心复审。
1.6更换试剂品牌应向科主任说明理由,由科主任上报采购中心,经招标、论证择优选用。
1.7自配试剂必须经过质量检测或比对后方可使用。试剂标签清楚,整齐,标签上要写明试剂名称、浓度、配制日期,配制人、有效期等,特殊保存要注明。1.8实验用纯水每天要用STD仪检测纯度(要求≤0.05ppm。每月采样一次送微生物室做细菌培养,不合格纯水不能用于任何实验。
1.9各实验室组长要做好试剂的请购、使用和保存工作,每月底要检查库存试剂,防止变质、过期和浪费,并及时请购,以保证日常工作。
1.10不定期的召开试剂管理小组会议,对近期试剂使用中的问题进行讨论解决,属试剂质量问题应及时反馈给采购中心,或及时与厂家沟通解决,必要时更换试剂品牌。
1.11试剂必须与化学药品分开存放,存放试剂的冰箱内严禁存放个人物品,并每天检查冰箱温度、做好记录。剧毒、易燃、易爆品要按要求保管并由专人负责、强酸强碱试剂要单独保存。具体参照《易烯、易爆、剧毒等危险品管理制度》。
1.12各实验室开展新项目需与科主任联系,核算试剂成本,选择优质试剂品牌。1.13试剂外借一律经科主任同意并履行手续(借条方可执行。2.试剂与校准品使用的管理
2.1使用检验试剂与校准品的人员必须具备临床检验工作资格,非检验人员不得擅自使用。
2.2使用检验试剂与校准品,必须如实填写试剂与校准品出入库登记表,以备清点检查库存情况,同时在包装盒上写明启用日期。
2.3从事检验工作的人员要掌握实验操作基本知识,认真阅读试剂与校准品使用说明书的相关要求,服从实验室管理人员的安排和指导。
2.4使用试剂与校准品过程中,必须严格按实验操作规程操作,严格执行《试剂管理制度》、《实验室生物安全管理规范》。
2.5实验结束后,应对试剂与校准品的名称、使用量与剩余量等进行核对,确认无误后,放入指定冰箱或指定位置储存。
2.6工作完成后,检查实验室污染情况,造成试剂或校准品污染的,应立即进行清洁处理,并做相应的记录。
2.7各专业组组长负责清点试剂与校准品,库存不足的及时申请补充,过期失效的及时清理。
2.8试剂管理小组负责定期检查《试剂出入库登记表》,并统计试剂与校准品的使用与库存情况,发现使用或登记中存在问题的及时向领导及相关责任人反馈并协同解决。
第五篇：动物性病原微生物的实验室检测常规方法简述
动物病原微生物的常规实验室检测方法简述
随着我国动物养殖业的飞速发展，动物传染病逐渐呈现出非典型性症状和混合感染的征状日趋严重，许多病例仅靠临床和病理诊断很难进行确诊，而实验室检测已逐渐成为动物病原微生物确诊的依据。目前，动物病原微生物实验室检测经常使用的方法主要包括病原学诊断，血清学诊断、分子生物学诊断。本文对动物病原微生物的实验室诊断方法进行简要的概括，为实验室诊断的初学者提供一些参考。1 病原学检测 1.1 涂片镜检
对于送检样品首先一般要进行涂片镜检，首先将样品涂片，然后根据临床诊断疑似感染病原情况进行染色，常用的染色方法主要有革兰氏染色、美蓝染色、姬姆萨染色和抗酸性染色法等，最后在光学显微镜下观察微生物形态，得出初步的结论。对于疑似的病毒性感染需要进行电镜观察，电镜是以电子束来代替可见光束，观察物体时，分辨率就没有波长要在可见光谱之内的限制，因此其放大倍数和分辨率都比光学显微镜高得多。病毒颗粒极其微小，在17-300nm之间，光学显微镜无法观察，只有电镜才可以发现其形态。1.2 分离培养
病原分离是病原微生物检测应用较广泛的方法，细菌、真菌、螺旋体和支原体需要将样品处理后接种到其特定的培养基中进行扩增培养，然后划线或涂到固体培养基上进行分离培养，通过其生长形态、生化特性作出鉴定。立克次体、衣原体、病毒则需要将样品接种到鸡胚或特定的细胞分离病毒，通过病变情况鉴定病原。分离培养需要的时间较长，且分离的病原可能不是致病主要因素，但是它是病原微生物的基本鉴定方法，是病原学检测的基础。1.3 动物接种
将样品处理后或分离培养的病原根据其不同的特性接种对待检病原敏感的实验动物，通过观察其是否发病和发病症状来进行判断，甚至还可以对发病实验动物继续分离培养病原。分子生物学检测 2.1 PCR
多聚酶链式反应，是目前病原检测的最常用的分子生物学技术，具有高敏感性的特征，即使少量的感染也可以检出，同时该方法也是许多其它检测方法的基础。其原理是将样品的基因组DNA提出，在加热条件下，DNA双链变性分离为单链，加入合成的保守区域的特异性引物，在合适的温度下和耐热聚合酶的作用下引导DNA的合成，循环重复后即可得到大量的目的基因片段，经电泳可以检测。RNA病毒需要提取的是RNA，反转录生成DNA后再进行PCR，即为RT-PCR检测。目前，PCR技术发展已日趋完善，像实时荧光PCR、套式、多重、降落PCR已逐渐成为实验室常规检测手段。2.2 核酸杂交
核酸杂交技术是较早的应用于病原微生物的检测技术，首先从样品中提取核酸（DNA或RNA），将此核酸进行变性处理后固定在固相载体上，加入带有特殊标记物的探针，利用碱基互补原理结合并固定探针，借助探针上标记的物质可以了解到是否有探针，甚至有多少探针被固定上去，再由此推知样品中是否含有、甚至含有多少病原微生物。根据杂交核酸的不同，又可分为Southern印迹法(检测DNA)及Northern印迹法(检测RNA)。此外，斑点和原位杂交也是常用病原检测技术。2.3 基因芯片
基因芯片技术在分子病原检测领域显示出了强大的生命力，主要是因为它具有微型化、集约化、标准化高通量的的特点。它的基本原理是将大量相似病原的基因保守片段的寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品或其PCR产物进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，特别适合数量较多的样品的鉴别诊断，在规模化养殖生产中非常具有应用前景。2.3 序列测定
序列测定耗时较长，但是比其它方法更为可靠，是确诊的依据。测序分为全序列测定和保守区域的测定，全序列测定主要是一些核酸序列较短的病毒，但有时为了对病原进行序列分析，有的细菌、支原体、衣原体等也进行全序列测定，但耗费巨大。3 血清学诊断
机体受致病病感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体，用已知的特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取动物的血清进行试验，故称为血清学诊断。
3.1 ELISA 又称酶联免疫吸附试验，是最常用的血清学诊断方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用于病原检验的ELISA主要有:双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体和ABS-ELISA法。3.2 补体结合反应
补体结合试验是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与病原及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象，而补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。该方法虽操作复杂但敏感性高、特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围也较广。3.3 间接免疫荧光
间接免疫荧光的原理与简接ELISA的原理相似，只是用荧光素替代酶标记抗体，主要是用来检测组织中的病原。首先将组织制成切片，加入能与待检病原进行反应的特异一抗，再加入荧光二抗，通过荧光显微镜就可以观察病原感染情况。以前制约免疫荧光方法使用的环节是荧光显微镜的数量太少，但随着荧光技术的发展，荧光显微镜已成为实验室里不可缺少的仪器。3.4 免疫胶体金
免疫胶体金技术是近年来发展最快的一种血清学诊断技术，它具有其它检测技术所无法比拟的简单、快速、准确和无污染的优点，具有非常广阔的临床应用前景。胶体金是由氯金酸在还原剂的作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。最常用的免疫胶体金主要有免疫胶体金光镜染色法，斑点免疫金渗滤法，胶体金免疫层析法。以上方法是动物病原微生物目前最常用的检测方法，每种待检样品都要根据其疑似病原的特性选择不同的方法，且大多数病原需要两种甚至两种以上的方法才可以确诊，这需要在实际应用中灵活选择。
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