第九节 菊花的组织培养(二)

第一篇：第九节 菊花的组织培养(二)

菊花的组织培养

（二）主讲：黄冈中学优秀生物教师 王小敏

回顾上节课：

一、植物组织培养的原理；

二、植物组织培养的基本过程；

三、影响植物组织培养的因素。

四、实验操作

（一）制备MS固体培养基

1、配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液。使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

2、配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，原因是菊花茎段组织培养比较容易。

3、灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

（二）外植体消毒

冲洗→酒精→无菌水冲洗→氯化汞→无菌水冲洗至少三次之上。

（三）接种、培养、移栽和栽培

1、前期准备：用70%的酒精消毒工作台，点燃酒精灯。注意所有接种工作都必须在酒精灯旁进行，器械使用前后都要用火焰灼烧灭菌。

2、接种操作：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。

3、培养过程应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度和光照。

4、移栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

思考：

1、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？

此时的组织或细胞是离体的，不能体现其整个植物体的光能自养，细胞所生活的环境必需是液体有机物的营养环境。

2、培养过程中为什么需要进行光照？

该培养过程是一个脱分化、再分化的过程。再分化过程中，愈伤组织分化出芽和根需要光的诱导；随着芽和根的形成，幼苗就具有了光合作用的能力，幼苗的生长和发育需要光照。

3、在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？ ①培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）②外植体的消毒（酒精、氯化汞）

③接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）④无菌箱中的培养；

⑤移栽到消过毒的环境中生存一段时间。

五、结果分析与评价

（一）对接种操作中污染情况的分析；

（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化；

（三）是否进行了统计、对照与记录；

（四）生根苗的移栽是否合格。

实例：下面植物组织培养过程示意图中还有什么地方不够完善的？

答案：没有进行灭菌处理，试管也没有做密封等。

1、污染的原因

污染：指在组织培养过程中，培养容器内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。

①细菌污染：

菌斑呈粘液状，界限比较明显，一般接种后1～2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。

②真菌污染：

菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子。接种后3～10天才能发现。主要是霉菌污染。

2、污染的主要途径

3、污染的预防措施

六、植物组织培养的特点及应用

（一）植物组织培养特点

1、培养条件可以人为控制。

2、生长周期短，繁殖率高。

3、能保持亲本的优良性状。

除花药离体培养属于有性生殖外，其他都属于无性生殖。

4、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。

（二）植物组织培养的应用

1、快速繁殖、培育无病毒植株

运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。

针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。

2、制作人工种子，解决某些作物的繁殖问题。

3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。

4、突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。

5、转基因植物的培育：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。

6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物——紫杉醇等，可通过组织培养方式大规模生产。课堂小结：

同步测试

一、选择题

1、植物组织培养技术的理论基础之一是（）

A．植物细胞的完整性

B．植物细胞的多样性 C．植物细胞的全能性

D．植物细胞杂交

2、要大量繁殖用植物体细胞杂交方法获得的植物，应该采用哪种繁殖方式（）A．种子繁殖

B．分裂生殖 C．出芽生殖

D．营养生殖

3、下列关于愈伤组织的说法中不正确的是（）A．愈伤组织的细胞能够进行细胞分裂

B．用叶培养形成的愈伤组织细胞能够进行光合作用 C．培养愈伤组织的培养基中应含有有机养料 D．人们可以从愈伤组织中提取所需物质

4、在一个多细胞生物体内，存在形态、结构和生理功能上具有稳定性差异的细胞，是因为（）A．细胞失去全能性

B．不同的细胞，基因是不同的 C．不同细胞中基因选择性表达的结果 D．变异一般是不定向的

5、细胞具有全能性的原因是（）

A．生物体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能 B．生物体的每一个细胞都具有全能性

C．生物体的每一个细胞都含有个体发育的全部基因 D．生物体的每一个细胞都是由受精卵发育来的

6、植物组织培养过程中的脱分化是指（）A．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞 B．未成熟的种子经过处理培育出幼苗的过程

C．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程 D．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程

7、下列植物细胞全能性最高的是（）

A．形成层细胞

B．韧皮部细胞 C．木质部细胞

D．叶肉细胞

8、植物组织培养是指（）

A．离体的植物器官或细胞培育成愈伤组织 B．愈伤组织培育成植株

C．离体的植物器官、组织或细胞培养成完整植物体 D．愈伤组织形成高度液泡化组织

9、某园艺场经过长期精心选育，培养出一株形态优美的兰花，如果要保持母本的优良性状，并尽快大规模繁殖，最适合的繁殖方式是（）A．分裂生殖

B．有性生殖 C．孢子生殖

D．组织培养

10、胡萝卜的韧皮部细胞通过组织培养，能发育成新的植株。下列有关的叙述中，不正确的是（）

A．说明高度分化的植物细胞具有全能性 B．植物细胞的全能性得以表达要离开母体 C．新植株的形成是细胞分裂和分化的结果 D．高度分化的动物细胞也具有全能性

CDBCC CACDD

二、非选择题

11、基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问：

（1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_____________等营养物质。

（2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_____________和_____________两类激素。

（3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_____________能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。

（4）试管苗的细胞核中含_________条脱氧核糖核苷酸链。

（5）培育成的试管苗可能出现的基因型有_____________。

显示答案

11、（1）水、无机盐、维生素和小分子有机物

（2）细胞分裂素

植物生长素

（3）叶绿体

（4）24

（5）AB、aB、Ab、ab

12、回答下列有关植物组织培养的问题。

（1）用于植物组织培养的植物材料称为________。

（2）组织培养中的细胞，从分化状态转变为未分化状态的过程称为________。

（3）在再分化阶段所用的培养基中，含有植物激素X和植物激素Y，逐渐改变培养基中这两种植物激素的浓度比，未分化细胞群的变化情况如下图所示，据图指出两种激素的不同浓度比与形成芽、根、愈伤组织的关系：

1）当植物激素X与植物激素Y的浓度比等于1时，______________________________；

2）________________________________________________________；

3）________________________________________________________；

（4）若植物激素Y是生长素，在植物组织培养中其主要作用是________；则植物激素X的名称是________________。

（5）生产上用试管苗保留植物的优良性状，其原因是________________。

显示答案

12、（1）外植体

（2）去分化（脱分化）

（3）1）未分化细胞群经分裂形成愈伤组织；

2）当植物激素X与植物激素Y的浓度比大于1时，未分化细胞群分化形成芽；

3）当植物激素X与植物激素Y的浓度比小于1时，未分化细胞群分化形成根。

（4）促进细胞的生长（伸长）、分裂和分化细胞分裂素

（5）组织培养形成试管苗的过程属于无性生殖，后代不发生性状分离。

解析：本题主要考查植物组织培养相关知识。

（1）植物组织培养的材料叫外植体；

（2）植物组织培养的核心过程是脱分化与再分化，脱分化指由分化状态变为未分化状态，再分化指由未分化状态变为分化状态；

（3）仔细分析所给示意图，可知植物激素X与植物激素Y浓度比为1时，利于愈伤组织的形成，大于1时利于细胞群分化出芽，小于1时利于细胞群分化出根；

（4）生长素在植物组织培养中主要作用是促进细胞生长、分裂和分化，植物组织培养过程中除需要生长素外还必需细胞分裂素，二者共同起作用；

（5）植物组织培养是一种无性繁殖技术，利于保持亲本的优良性状。

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课外拓展

兰花的组织培养

法国人莫瑞尔（G.M.Morel）首先将组织培养的技术应用在兰花上，采取茎顶组织进行培养，经由类原球体而获得植株。

利用组织培养进行芽体增殖是另一个获取种苗的方法，例如，蝴蝶兰便利用花梗芽进行繁殖，这种方法的缺点是繁殖的效率较差，而且成本较高。由于芽体是经由多细胞发育而成，并不适合做为基因转殖的材料。以单细胞做为基因转殖的起始点是最好的方式，而且可以避免得到嵌镶体。不过，目前以细胞来复制兰花还只局限于几个种类，如文心兰、素心兰及蝴蝶兰等，无法广泛使用。以细胞复制兰花

以细胞复制文心兰为例，可以采取花梗、根、茎及叶做为培植体，将这些培植体置于合适的人工培养基，一至两个月后，愈伤组织从根尖、茎及叶培植体的切口部位长出。这些诱导出来的愈伤组织可以不断地继代培养于相同的培养基，形成更多的愈伤组织，而且数年之内仍具有再生植株的能力。如此一来，我们便可以维持复制文心兰的系统，不需要每次都从培植体去诱导新的愈伤组织。

获得大量愈伤组织后，便要进行体胚诱导的工作。一般而言，诱导体胚所需要的培养基配方会不同于继代培养时所用的。将愈伤组织转移至诱导体胚的培养基，大约一个月后，可以观察体胚的形成。理论上，每个细胞都可以产生一个体胚，所以一小块愈伤组织便可以诱导出数十甚至数百个体胚。

接下来的工作便是将这些体胚培育成为完整的小植株，通常需将体胚转移至另一不同配方的培养基。体胚逐渐发育形成原球体。这些自体细胞而来的原球体和种子发育而来的原球体，在形态及发育能力上并没有明显的差异，两者皆可以发育成为正常的植物。只是同一来源的体细胞所形成的原球体具有相同的遗传组成，而种子来源的原球体则皆具有不同的遗传组成。数个月后，原球体发育成为具有地下部及地上部的小植株，待小植株成长至一定大小后，便可以进行驯化的工作。将小植株移出瓶外，种植于栽培容器并移至具有遮阴及喷雾设施的温室进行驯化，可以得到将近百分之百的存活率。

除了以细胞复制文心兰之外，素心兰、蝴蝶兰及拖鞋兰等都可以经由愈伤组织诱导出小植株，这些小植株也都能正常的生长。素心兰的愈伤组织是从根茎等营养器官诱导而来的，愈伤组织在继代的过程中形成体胚，这些体胚并不形成原球体而是发育成为根茎，然后才形成小植株。虽然蝴蝶兰及拖鞋兰都可以利用愈伤组织来繁殖，但未来仍需进一步以营养器官或组织来诱导愈伤组织，才能针对特定的优良品种进行繁殖。

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高考解析

例、（北京）以下不能说明细胞全能性的实验是（）A．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B．紫色糯性玉米种子培育出植株 C．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株 解析：

植物细胞全能性是指已高度分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。应用植物细胞的全能性可以进行植物的组织培养，如胡萝卜韧皮部细胞培育出植株；还可以进行植物体细胞杂交，如番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株；另外，在转基因作物的培育中，可以将目的基因DNA微管注射到受体细胞，再利用植物细胞全能性培育出植株，虽然这个操作以基因重组的理论为基础，但也应用了植物细胞全能性的理论。而B是由种子发育为个体，属于有性生殖，不能说明细胞的全能性。答案：B

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第二篇：《菊花的组织培养》说课稿

《菊花的组织培养》说课稿

尊敬的评委老师、工作人员：

大家好！我是几号考生。

（现在开始我的说课）

今天我说课的内容是《菊花的组织培养》第一课时，主要包括教材分析、学情分析、教学目标、教学重难点等几个部分

（首先谈谈我对教材的理解）

一、教材分析

《菊花的组织培养》是人教版高中生物选修一，属于生物技术在其他方面应用范畴。主要内容是植物组织培养的基本原理和过程。它是在学生学习了细胞分化、育种及微生物的培养等知识的基础上进行的，也为月季的花药培养的学习奠定了基础，因此有着承前启后的作用。

（下面，谈谈我对本节课所面对的学习对象的特点）

二、学情分析

高二的学生，经过前面的学习，具有一定的生物知识储备，且认知能力不错，但他们思维的连续性和逻辑性不强，自主设计实验意识薄弱，故本节课采用启发和引导的探究方式实施教学，锻炼他们的逻辑思维能力，增强设计实验能力。

（根据新课标理念，教材特点，学生的认知能力，我确定如下为本节课的教学三维目标）

三、教学目标

1.知识与技能目标：

说出植物组织培养的原理；概述植物组织培养的基本过程。

2.过程与方法目标：

通过学习植物组织培养技术，增进对生物技术的了解。

3.情感态度与价值观目标：

初步养成求实、创新及勇于探究的科学精神和科学态度。

（基于以上我对教材、学情、教学目标的分析，我确定如下为本节课的教学重难点）

四、教学重难点

重点：植物组织培养的基本过程。

难点：植物组织培养的基本过程。

（为了突出重点，突破难点，顺利达成教学目标，我将采用以下教学方法）

五、教学方法

教法：问题导学法、多媒体教学法、读书指导法、任务驱动法。

（德国教育学家第斯多惠说过：一个差的教师只会奉送真理，而好的教师教会学生发现真理。）

学法：自主探究法、合作交流法。

（下面，进入到本次说课的重点部分）

六、教学过程

1.创设情境，导入新课

用多媒体展示菊花组织和成活的菊花图片，说明成活菊花是由该组织发育而来，这时学生肯定说明好奇，觉得不可能啊，这样引起了学生学习的学习兴趣，也激发了他们的求知欲。同时也导出了本节课的课题：菊花的植物组织培养（板书）。

2.合作探究，新课教学（分两个模块）

A.植物组织培养的基本过程（板书）

首先采用问题导学法，让学生对植物组织培养的基本过程有个清晰的认识，在学生回顾旧知——细胞分化的概念后，再分别思考如下问题：

（1）同学们，你们知道什么是脱分化和再分化吗?

（2）愈伤组织又是由什么细胞组成的呢?

（3）脱分化和再分化后分别生成什么?

通过以上问题的解决，学生对植物组织培养的过程有了基本了解，这时再引导学生归纳出植物组织培养的流程图，学生自主思考后，老师再展示完整清晰的流程图。

（板书）植物组织—愈伤组织—长芽—生根—成体植株

（过渡）既然组织可以直接培养成成体植物，那它有什么限制条件吗?由此进入第二模块的教学。

B.影响植物组织培养的因素（板书）

这里先让学生认识到不同植物组织的培养影响因素不同，即使是同种植物材料，材料的年龄、保存时间都会影响培养结果。接下来结合多媒体上的表格一同探究植物组织培养的影响因素，表格的内容主要为影响因素、各因素的作用和适宜范围。通过老师引导学生合作探究完成表格后，学生对植物组织培养的影响因素大致理解。对于生长素和细胞分裂素不同使用顺序下的不同实验结果及它们用量的比例、浓度差异对实验的影响，我会着重介绍。

（过渡）同学们都知道植物要植根于土壤或营养液中，那么植物组织又在哪里完成分裂分化呢?这样顺势就进入了第三模块。

C.制作MS固体培养基（板书）

本模块先向学生介绍MS培养基，让他们了解MS培养基。然后让学生阅读教材完成如下问题：同学们，你们知道了MS培养基有20多种营养成分，为了避免每次配制时的称量麻烦，你觉得你应该怎么办呢?

以上问题学生思考得以解决后，再让学生自主归纳出培养基的配制步骤，同学之间相互评价，发挥自评互评的作用，然后老师再播放培养基配制的动画过程，这样学生对培养基的配制就有透彻的认识了。培养基配置好后，学生自然而然就知道要灭菌了，因为专题二微生物的培养里教授过相关知识。

以上教学都是为后面外植体接种或继代转瓶操作做好准备，打下了知识基础。教学过程的设计主要采用学生自主探究与合作交流的方法，既锻炼学生自主学习能力，又实现了教师主导，学生主体作用；让学生了解生物技术在社会生活、生产、发展中的作用，对学生进行STS教育。

3.共同归纳，巩固提高

师生共同梳理本节课的所学内容，并画出知识概念图，锻炼学生的总结归纳能力。

4.拓展升华，小结作业

小结：让学生快速浏览这节课的知识并口述自己的收获。

作业：课外查阅资料，了解植物组织培养的发展状况并相互分享。

七、板书设计

（最后请问考官是否需要擦黑板，结束！）

第三篇：菊花的组织培养实验设计

菊花的组织培养实验设计

实验名称 年级、组 组 员菊花的组织培养实验设计 2012级10班 第5组

杨素华、叶利萍、佐尚秀

李定峰、欧 霞、刘新鹏

刘昌恒、颜政委、李元凤

2014年12月6日

菊花的组织培养实验设计

一 实验目标

1.掌握植物组织培养的原理。

2.学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。

二 实验原理

植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性，在适宜的条件下，细胞具有形成一个新的个体的潜在能力。细胞全能性(totipotency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个完整机体的全套基因.植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

三 实验材料

1.实验设施

培养基制备、灭菌和材料处理室、高压灭菌锅、无菌接种室、组织培养室、水浴锅、超净工作台或简易接种箱、2.实验仪器

解剖刀、三角烧瓶（100mL）、烧杯、量筒、锥形瓶、容量瓶、移液管、培养皿、封口膜、棉线、分析天平、长镊子、剪刀、牛皮纸、圆滤纸。

3.实验材料

在晴天，最好是中午或下午采集无病毒、无病害、生长良好的，易于诱导的未开花的菊花植株茎上部新萌生的侧枝为组织培养材料。

4.实验试剂

准备制备MS培养基、乙醇、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、氯化汞（升汞）或次氯酸钠、琼脂、6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）或2,4-D（生长素类似物）、萘乙酸（NAA）及蔗糖

四 实验的具体操作过程

1.配置培养基

（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2，4–D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。

（2）试验培养基：在MS培养基中加入IAA和6–BA。吲哚乙酸（IAA)先用少量0.1mol/LNaOH溶解，6-苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1mol/LHCl溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

2.灭菌 待灭菌的物品有：培养基、装有滤纸的培养皿等

具体灭菌步骤是：先将蒸馏水装入1000mL锥形瓶的3/4处，用封口膜和牛皮纸两层封口，再将装有滤纸的培养皿包起来，然后，连同已配置好的培养基一起放入高压灭菌锅内，在1.2个大气压下灭菌 10~15min，冷却后备用，注意灭菌时间不得超过15min，以免培养基变性。

3.组培材料的灭菌 4.接种

无菌接种前：用70％的酒精消毒工作台，点燃酒精灯。所有工作都必须在酒精灯控制下进行，器械使用前后都要用火焰灼烧灭菌。

接种操作：插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体，接种后将封口膜重新扎好，后送进组培室。

5.培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，温度控制在18~22摄氏度，相对湿度应保持在60%~70%，每天应保证至少12h的光照，光照强度约为1500Lx，也可使用自然光。根长>1cm时，可出瓶移栽。

6.移栽与栽培：移栽前，打开封口膜，在培养间生长几日；移栽时候，用流水将依附于小苗根部的培养基洗净，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

五 注意事项

1.材料的选择与处理

尽量选择未开花植株的茎上部分新萌生的侧枝，带菌少，易诱导。外植体消毒要足够，减少外植体自身带菌造成的误差

2.控制好培养条件

接种时全程无菌操作，温度控制在18-22摄氏度，不宜过高伤害外植体，PH在5.8左右。

第四篇：组织培养课程感想

植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。外植体： 愈伤组织：

一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；

（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。

（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；

（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。

二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。

1、根据培养材料不同分为：

（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。

（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。

（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。

（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。

（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。

（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。

三．植物组培的应用 1.植物离体快繁。2.无病毒苗木培养。

3.培育新品种或创制新物种。4.次生代谢物生产。

5.植物种质资源的离体保存。6.人工种子。

1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。2.）器具的灭菌：

1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。

（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。

（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃ 15－20分钟。

（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。

2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20分钟。培养基体积越大，灭菌时间越长。

3、不耐高温化合物：采用过滤灭菌，如IAA等。

4、外植体的表面灭菌： 采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分钟）等。杀菌剂中加入几滴吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好。3）无菌操作：

1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。

2、保持超净工作台的洁净：接种前用70％乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70％乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。

3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。

4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。

5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。4）通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S，微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等 有机成分、主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L, 通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。植物生长调节剂、常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：

1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D

2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip

3、赤霉素类：GA3、GA4、GA7

4、脱落酸：ABA

5、乙烯：ETH 碳源、碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2－5％，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。

琼脂以及其他附加物等。琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在4～10g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80％。

5）培养基的具体步骤：取出母液并按顺序放好，将有机营养物质贮液融化待用；取一只烧杯，放入三分之一左右纯水，将母液按顺序加入并不断搅拌；加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热视其溶解；调ph；分装封瓶；灭菌；冷却取出待用。

1）植物细胞的全能性（Totipotency）即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。

2）分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。

3）脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。

4）植物胚胎发生：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。1）植物离体培养中再生植株有哪些途径？

根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。（还有先根后芽，先愈伤再根芽）离体培养中再生植株的主要途径有：

器官发生；器官型（直接由外植体的细胞形成器官原基），器官发生型（外植体先形成愈伤组织，再产生器官原基）

胚胎发生（与合子胚的发生过程类似，体细胞胚在形态和生化水平上和合子胚都相似。）2）愈伤组织是如何形成与生长的？

在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。

分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织，细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。3）植物体细胞胚胎发生有哪些途径？

直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段：

（1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。（2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。

4）影响植物离体形态发生的因素有哪些？

一、植物种类和基因型

1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。

2、同一物种不同基因型间存在较大差别。

二、培养材料的生理状态

1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高；

2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；

3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。

三、培养基

1、营养成分

一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。

茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。

茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。

2.植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）

（1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 – D诱导体细胞胚胎发生。

（2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。

（3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。（4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用

（5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。

3、培养基的性质

（1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。（2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。

（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高.四、培养条件

1、光照培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。光强一般要求1000-5000lx。植物间有所差别。光照周期为10~16h/日。不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。

2、温度：大多数培养温度为25±2℃.花药培养低温或高温预备处理。

3、气体：氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。

5）、体细胞胚胎发生的两个特点：双极性；母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。

第五篇：植物组织培养论文

植物组织培养的发展及其应用

刘兆书、王梦瑶、王瑞雄、尹树明、左通通

（石河子大学，生命科学学院，新疆石河子，832000）

摘要:植物组织培养作为一种有效的技术手段已被广泛应用于生产实践的各个领域。本文从植物组织培养技术的发展，总结了植物组织培养的发展历史及发展现状，重点介绍了组织培养技术在育种和脱毒快繁方面的应用，为今后植物组织培养的进一步发展和应用打下基础。

关键词：植物组织培养；发展；快繁；脱毒；育种

德国的植物生理学家Haberlandt提出细胞全能性理论以后，在无数科学家的努力下，植物组织培养经过近百年的发展历程后，该技术日趋完善和成熟，得到了广泛的应用。随着科学技术的不断发展，研究领域的不断拓展与深入，植物组织培养技术的应用也越发的广泛。育种方面的应用非常广泛，已经形成了一门理论和技术；在工厂化育苗方面，产生巨大的经济及社会价值;同时植物组织培养技术的发展也促进设施农业、食品、工业、医药业等领域发展，现就植物组织培养技术的发展和应用作简单总结。

1、植物组织培养的发展

1.1植物组织培养的发展历史

1838-1839年，德国的植物学家T.Schleidon和动物学家T.Schwann提出细胞学说。1902年德国的植物学家Haberlandt提出:高等植物的器官和组织，具有植物细胞全能性。1904年Harming在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行培养，发现离体胚可以发育成熟，并提前萌发成小苗。1937年White发现了B族维生素，建立了第一个由已知化合物组成的培养基，该培养基被定名为White培养基。同时法国的Gautherer和Nobecourt也发现了B族维生素的重要性，三个人被誉为植物组织培养学科的奠基人。1952年Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得脱毒植株。1953-1954年Muir利用震荡培养和机械方法获得了万寿菊和烟草的单细胞，实施了看护培养，使单细胞培养获得了成功。1957年Skoog和Miller提出生长素和细胞分裂素控制器官形成。1958年英国学者Steward通过体细胞胚胎发生途径获得了人工体细胞胚，这一实验证实了Haberlandt的细胞全能性理论。到20世纪60年代组织培养进入快速发展阶段，在基础理论、实际操作方面不断取得进展，比如在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面取得了可喜的成果。

1.2植物组织培养发展现状

1.2.1国内的研究发展现状 我国的组织培养与国外相比起步相对较晚，但发展却比较快。20世纪70年代我国掀起了单倍体育种的高潮，在作物育种上取得了一些实用性的成果。据不完全统计，目前我国用花药或花粉育出的植物已超过22科52属160种。目前我国组培已经进入了生产阶段，实现了花卉、果树、蔬菜等100多个品种的工厂化生产。花卉出口年创汇达800多万美元。

1.2.2国外植物组织培养的研究发展现状 国外的组培发展的比较快，20世纪70年代在美国形成了兰花产业。80年代后，以商品为目的的组培苗生产量以20%-30%的速度递增，年产组培苗在10万株以上的植物微繁殖公司约占50%，年产量大于50万株的公司约占25%，整个西欧年产组培苗达2亿多株。

2、工厂化植物快繁及脱毒方面的应用

组织培养技术有几乎不受地理环境和季节的限制、遗传背景一致、生长周期短、成本低等诸多优点。同时，结合茎尖培养方法可以去除植物病毒、使植物复壮、提高质量和产量，所以，离体快繁和植物脱毒是目前植物组织培养应用最广泛的一个方面，尤其在兰花、名贵树种、马铃薯、草毒等无性繁殖为主的植物显的更是尤为重要。据估计，目前全球有关生物技术产业的年交易额约为1 500亿美元，其中50%一60%与农业有关。植物组培苗的贸易额约占总额的10%，即150亿美元，并以每年15%速度递增。

在我国，离体快繁育苗技术的开发应用起步于20世纪80年代初。如华乐种苗有限公司，年生产能力在500万株以上兰花克隆苗，主要出口日本、美国、荷兰、德国等，北京杉友兰业生物科技有限公司，年生产能力为350万株兰花克隆苗，连云港振兴恒巨生物科技有限公司，年生产蝴蝶兰克隆苗3 000万株，产品远销欧洲、美洲、亚洲等十多个国家和地区。据不完全统计植物快繁涉及观赏植物、蔬菜、果树、药材等300种以上，其中观赏园艺植物约200种，约占60%。在脱毒方面，如通过脱毒的马铃薯、甘蔗、甘薯、大蒜、草毒、香蕉平均可以增产30%以上，兰花、水仙、康乃馨、大丽花通过脱毒后植株生长势强、花色艳丽、花朵大、产量高。

3、在植物育种上的应用

植物组织培养技术对培育优良作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已把植物组织培养普遍应用于作物育种，并在单倍体育种、胚胎育种、细胞融合育种、细胞突变育种、基因工程育种等方面取得了较大进展。3.1单倍体培养育种

通过对植物的花药、花粉、未受精的子房或胚珠进行组织培养获得单倍体(其中以花药和花粉培养应用最为广泛)，单倍体在培养过程中利用秋水仙素处理，可使染色体加倍，成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。研究表明，常规育种一般需要8-10 天或更长的时间，而通过单倍体进行育种一般仅需要4-5 天的时间，单倍体育种具有程序简单、育种周期短、基因型一次纯合等优点，单倍体育种是常规育种程序和方法的重大改革，尤其在林业等生长周期长的物种中效果更为显著。因此，单倍体育种在国际上引起了很大的重视，各国纷纷开展单倍体育种方面的研究工作。3.2胚胎培养育种

植物的胚(包括成熟胚和幼胚)、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术统称为胚胎培养，其应用领域主要包括胚胎发育机理、克服杂交不亲合、胚胎拯救、克服自交不亲和、克服珠心胚的干扰、打破种子体眠、获得体细胞胚和人工种子等方面，因此在农作物、园艺作物、林木和药用植物上有着广泛应用。

在克服杂交不亲合、克服自交不亲和方面主要通过植物离体受精来实现，在广义上通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等均称做植物离体受精。但严格意义上的离体受精或试管受精是20世纪90年代精、卵离体融合成功。该技术不仅可以克服植物授粉不亲和问题，还可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养，已在玉米、药用牡丹、婴粟、烟草等植物上获得成功。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术，为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统，为开发新的植物转基因途径提供了可能。

胚培养在打破种子体眠应用较为广泛，种子体眠的原因很多，利用组织培养方式打破种子体眠一般有种胚发育不全或种子含抑制物抑制种胚发芽2种情况，如胚乳发育尚不完全的兰科种子可以通过组织培养的方式获得再生植棵，而莺尾属、蔷薇科、野麦等植物可以通过组织培养的方式打破抑制物对种子发芽的影响。另外，胚培养还可以应用于胚胎拯救。

胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株，再经过染色体加倍获得六倍体，从而育出多倍体新品种。目前有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化或器官分化，不少植物已获得了再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、称猴桃等多种植物上得到了胚乳再生植株。同时，胚乳培养产生的混倍体，可用于染色体工程方面的研究。3.3细胞融合培养育种

细胞融合所使用的材料一般是指利用除去植物细胞壁的裸露细胞即原生质体，通过原生质体融合，可克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍，为广泛重组遗传物质开辟了新途径。同时，因去壁后的原生质体消除了核酶等对外源DN A的破坏，为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条伴。另外，在有些没有有性生殖能力或其有性生殖能力很低(如香蕉、木薯、马铃薯、甘蔗等)的植物作物改良中，体细胞杂交具有不可取代的重要性。通过大量的研究认为叶肉组织分离的原生质体较好，遗传性较为一致。在原生质体融合方面主要有物理(如电融合)、化学(如高PIE高钙、聚乙二醇)、生物(如仙台病毒)等融合方式。3.4细胞突变体育种

在研究中发现，通过愈伤组织获得的再生植株中常常出现基因型变异。这是因为无论是愈伤组织还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界环境(如物理因素、化学物质等)的影响而产生诱变。利用这一特点结合人工诱变方法包括物理诱变(Y射线、X射线、电子束、离子束、激光、紫外线等)、化学诱变(甲基磺酸乙醋、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、52BU ,EB等)和生物诱变(转座子插入突变、跳跃基因等)获得了一大批植物新品种和新材料。目前，这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的植物突变体。

3.5基因工程育种

通过基因枪或农杆菌进行植物基因工程育种的关键环节之一是建立一个高效的组织培养再生体系。植物遗传转化的理想受体系统应具有高效稳定的再生能力，研究认为用于基因转化的受体系统，应具有80%-90%的再生频率，且每个外植体必须具有能再生的丛生芽，其芽数量越多越好。目前，用于遗传转化的受体主要有二种途径，一是外植体在激素的诱导下产生愈伤组织后再培养成体细胞胚即体细胞胚发生途径，二是诱导外植体产生单极性不定芽后再培养生成完整的再生植株即器官发生途径。目前，与组培技术结合的转基因的方法主要有农杆菌介导和基因枪两种方法。

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