牛奶中酪蛋白和乳糖的分离、鉴定

第一篇：牛奶中酪蛋白和乳糖的分离、鉴定

牛奶中酪蛋白和乳糖的分离、鉴定(杜青 胡弘毅)

牛奶中酪蛋白和乳糖的分离、鉴定

杜青 胡弘毅

（化学与分子科学学院；湖北 武汉 430072）

摘要：本文介绍了从牛奶中分离酪蛋白和乳糖的方法，和鉴定酪蛋白的方法。关键词：酪蛋白、乳糖、等电点、分离

1.引言

牛奶是营养最完备的食品之一，这一点已为许多人认识并接受。尤其是在婴儿及青少年时期，每天一定量的牛奶能促进身体健康成长。牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质。

牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白。酪蛋白是含磷蛋白质的复杂混合物，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，把牛奶的ＰＨ值调到酪蛋白的等电点(ＰＨ =4.8)来沉淀分离酪蛋白。酷蛋白不溶于乙醇和乙醚，所以可用乙醇和乙醚将其中的脂肪洗涤除去。

牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖。它是唯一由哺乳动物乳糖合成的糖，它是在乳腺中被合成的。乳糖是成长中的婴儿建立其发育中的脑子和神经组织所需的物质。乳糖也是不溶于乙醇的，所以，当

2.材料与方法

2.1 实验仪器

恒温水浴锅、抽气抽滤瓶、布氏漏斗、蒸发皿、烧杯600ml、100ml各一个、表面皿、天平、玻璃棒。

2.2 主要试剂

10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、伊利牌纯牛奶、精密PH试纸（PH=3~5）、碳酸钙、滤纸、1%CuSO4溶液、10%NaOH溶液、茚三酮溶液。

2.3 实验过程

2.3.1 酪蛋白的分离

取三份20ml新鲜牛奶于100ml烧杯中，在恒温水浴中加热至45℃，边搅拌边慢慢加入10%醋酸溶液，通过PH试纸测量至牛奶PH分别为4.8、4.6和3.8。放置冷却、澄清后，抽滤。注意先将上层清液滤出，再将沉淀倾入漏斗中。（滤完后，在滤液中加入少量粉状碳酸钙留作乳糖的分离。）再依次用95%乙醇、乙醇乙醚等体积混合液、乙醚洗涤酪蛋白。用乙醚洗涤时，注意用玻璃棒捣碎成团的固体，并反复翻洗，保证脂肪被洗净。将洗净的酪蛋白移至表面皿上，自然晾干后称重。

2.3.2 酪蛋白的鉴定（在酪蛋白分离后立即完成效果最好）

取少量酪蛋白颗粒于试管中，加入少量水溶解。

取10ml酪蛋白溶液，加入茚三酮溶液5滴，振荡，放入沸水浴中加热2分钟，溶液呈淡紫色。（茚三酮反应）

取10ml酪蛋白溶液，加入10% NaOH溶液2ml后，滴入1%CuSO4溶液1ml。振荡试管，溶液呈蓝紫色。（缩二脲反应）

取10ml酪蛋白溶液，加入浓硝酸2ml后加热，有黄色沉淀生成。再加入10%NaOH溶液2ml，沉淀为橘黄色。（蛋黄颜色反应）

2.3.3 乳糖的分离

将2.3.1中滤液用倾滗法倒至蒸发皿中，用蒸汽浴浓缩至5ml后，将热的混合物用布氏漏斗抽滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙。加热滤液，在热的溶液中加入95%乙醇18

ｍl，并继续加热，待其混合均匀后，趁热过滤，滤液应澄清。把滤液移至锥形瓶中，加塞，放置 1-2天，让乳糖充分结晶。抽滤，分离出乳糖晶体，并用冷的95%的乙醇水溶液洗涤产物，待其干燥后称重。

3．结果与讨论

3.1不同PH值的酪蛋白的实验现象

PH值调到3.8的牛奶,酪蛋白迅速沉淀下来，抽滤的速度也很快，鉴定酪蛋白的几个性质试验现象都十分明显，而且滤液十分澄清，但滤液中只析出微量絮状乳糖。可能是酸的浓度太大，乳糖被大量水解。

PH值调到4.8的牛奶，酪蛋白的沉淀速度很慢，抽滤的速度也很慢，而且抽不干，滤液是浑浊的。

PH值调到4.6的牛奶，酪蛋白沉淀速度和抽滤速度处于上面两种情况的中间，得到3.1g 酪蛋白，性质试验现象明显。滤液略显乳白色，得0.23g乳糖，乳糖呈片状晶体。

3.2奶中脂肪的影响

脂肪也是牛奶的主要成分之一，约占牛奶的3.9%,在分离酪蛋白时，脂肪回夹杂在酪蛋白中一起沉淀出来。因此，在用乙醚洗涤酪蛋白时，应把任何形状的酪蛋白捣碎，并用玻璃棒搅拌约10min，尽可能出去脂肪。否则，酪蛋白长时间放置后会焦化变黄。

3.3碳酸钙的作用

本实验中所使用的碳酸钙，主要是用以中和过剩的乙酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，从而影响收得率。

乙醇混入水溶液中时,乳糖会结晶出来 ,从而达到

…¿报名分离的目的。

第二篇：大豆分离蛋白的主要工艺流程

大豆分离蛋白的主要技术性能指标 水份：≤6% 干基粗蛋白：≥90% 水溶氮指数：≥60% TPC：≤10000个 大肠杆菌：0个 色泽：浅黄/乳白

气滋味：具有分离蛋白特有的气滋味 PH值：6.8～7.2 密度：过200目筛95%，过270目筛 90% 产品的功能特性将根据不同应用领域来确认

乳化型：通过1（蛋白）：4（水）：4（脂肪）的测试，肠体光亮、有弹性，无油、水渗出。

高凝胶型：通过1（蛋白）：5（水）：2（脂肪）的测试，肠体光洁度好，有弹性，无油、水渗出。

高分散（注射）型：1:10(蛋白:水)试验：稍搅拌溶解，静置三分钟无分层，0.5mm注射针头完全通过。大豆分离蛋白工艺流程

低温豆粕——萃取——分离——酸沉——分离——水洗——分离——中和——杀菌——闪蒸——干燥——超细粉碎——混合造粒——喷涂——筛选——金属检测——包装 工艺简要描述：

萃取：将大豆低温豆粕置入萃取罐中按1：9的比例加入9倍的水，水温控制为40C0，加入碱使溶液在PH为9的条件下低温豆粕豆粕中的蛋白溶解于水中。

分离：将低温豆粕溶液送入高速分离机，将混合溶液中的粗纤维（豆渣）与含有蛋白的水（混合豆乳）分离开。豆渣排到室外准备作饲料销售。混合豆乳回收置入酸沉罐中。

酸沉：利用大豆蛋白等电点为4.2的原理，加入酸调整酸沉罐中混合豆乳的PH到4.2左右。使蛋白在这个条件下产生沉淀。

分离：将酸沉后的混合豆乳送入分离机进行分离，使沉淀的蛋白颗粒与水分离。水（豆清水）排入废水处理场治理后达标排放。回收蛋白液（凝乳）到暂存罐。

水洗：按1（凝乳）：4的比例加水入暂存罐中搅拌。使凝乳中的盐份和灰份溶解于水中。

分离：将暂存罐中的凝乳液送入离心机进行分离。水排入废水处理场治理达标排放，凝乳回收入中和罐。

中和：加入碱入中和罐，使凝乳的PH调整到7。杀菌：将中和后的凝乳利用140C0的高温进行瞬时杀菌 干燥：将杀菌后的溶解送入干燥塔，在干燥温度为180C0的条件下将溶解干燥。

筛选：对干燥的大豆分离蛋白进行初步筛选。使98%通过100目标准筛。

超微粉碎：用特殊超微粉碎机对产品进行粉碎，使90%通过200目标准筛造粒：产品随后进行造粒设备进行造粒，使产品粒度均匀。

筛选：对产品进行进一步筛选。

喷涂：在产品表面喷涂表面活性剂，提高产品乳化稳定效果。金属检测：对产品进行金属检测。

包装：检测后的产品进行自动包装系统，按规定的重量进行包装。

第三篇：细菌分离鉴定

细菌分离鉴定

目的要求：

熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。

实验内容：

一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定

(一)标本采集

1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。

3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。

4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。

5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。

6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。

(二)分离鉴定程序

待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。

直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)

脓、痰、咽拭子

分泌物、脑脊液 观察菌落性状、溶血性、色素

血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检

↑ 挑取可疑菌落 生化反应

血液、穿刺液 →肉汤培养基 纯分离 致病性测定

↓ 药敏试验

如培养液混浊时可涂片、染色、镜检

(三)常见临床标本的检查方法

1．脓拭子

在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。

材料

(1)标本：脓拭子

(2)培养基：血琼脂平板

(3)兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片

方法 脓汁 → 革兰染色 → 镜检

↓ ↑

血琼脂平板 →观察菌落形态及溶血情况

↓

致病力试验

(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

(2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。

(3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本，重点检查病原性球菌。

材料

(1)标本:咽拭子。

(2)培养基:血琼脂平板。

方法

咽拭子

↓

血琼脂平板

↓

观察菌落形态及溶血性

↓

革兰染色，镜检

取标本涂布于血琼脂平板，再以灭菌接种环划线分离，置37℃培养18h～24h培养。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

可根据下述特点进行鉴别：

(1)在菌落周围产生2mm～4mm宽、界线分明、完全透明的溶血环、涂片为革兰阳性球菌并呈链状排列，可能是乙型溶血性链球菌。

(2)菌落细孝半透明、有草绿色溶血环、涂片为革兰阳性球菌呈链状排列，可能为甲型溶血性链球菌。需要进一步与肺炎球菌区别时，可做胆汁溶菌试验及菊糖发酵反应。

菌落细小半透明、不溶血、涂片为革兰阳性链状排列的球菌时，为丙型链球菌。

(4)菌落扁平边缘隆起、中央稍凹、半透明、呈草绿色溶血、革兰染色为阳性双球菌、呈矛头状排列时为肺炎球菌，应以胆汁溶菌及菊糖发酵反应与甲型溶血性链球菌区分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革兰染色为阴性双球菌，呈肾形排列时，可能为脑膜炎球菌，需要进一步作氧化酶试验及糖发酵试验(接种于含血清之葡、麦、蔗糖发酵管中)。

二、粪便标本中肠道杆菌的分离与鉴定

(一)标本收集

取患者的粪便或肛-门拭子。

(二)鉴定程序

肠道杆菌为一大群革兰阴性杆菌，从形态及染色性上无法鉴别为何种菌，只能依靠生化反应和血清学反应进行鉴定。

患者粪便(粘液、脓血)→肠道选择、鉴别培养基(如ss、中国蓝、伊红美兰)

↓

挑取可疑菌落(据大孝颜色、透明度而定)

↓

双糖铁及其他鉴别培养基

↓

据结果分析鉴定

↓

玻片凝集(做出特异性诊断)

葡萄糖乳糖动力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌属非致病菌

⊕+---克雷伯菌属

⊕±+++变形杆菌

⊕-++-乙型副伤寒致病菌

⊕-+±-甲型副伤寒

+-++-伤寒杆菌

+----痢疾杆菌

第四篇：水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定 - 20150909

水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定

摘要 目的：大曲是山西著名品牌水塔老陈醋发酵的主要原料，其富含多种微生物，研究大曲中酵母菌的组成对老陈醋的发酵生产有重要的指导意义。方法：采用传统分离培养方法，即通过富集培养再稀释涂布、分离纯化出21株酵母菌，对其进行形态学观察、镜检，并且扩增和测定了它们的5.8S-ITS、18S、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。结果：测序结果与GenBank 中已知序列进行比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。结论：大曲中含有多种酵母菌，分离培养和分子生物学鉴定了酵母菌的种类，为纯种制曲打下了基础。

关键词：大曲，酵母菌，分离，鉴定

大曲是我国传统酿造酒和酿造食醋生产中主要的原料。大曲是酒和食醋酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前提的主要来源[1-2]。大曲中含有多种微生物，可起到糖化、发酵、增香的作用，直接或间接地影响酒和醋的风味及口感。然而，大曲采用开放式富集培养，受场地、工具和制曲室环境以及水、空气等多种因素影响，大曲质量难以得到稳定，同时富集式培养使大曲富含多种微生物，包括功能性微生物和无效、有害微生物，难以保证大曲的质量稳定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影响酒和老陈醋的发酵生产及口感。分离鉴定大曲中酵母菌的组成，成了近几年酒和食醋的研究热点[4-9]。分离鉴定水塔老陈醋大曲中酵母菌的组成，对提高著名品牌水塔老陈醋的产量和质量有很重要的意义。

采用富集培养再稀释涂布、分离水塔老陈醋大曲中的酵母菌，之后对其进行形态学观察、镜检，扩增和测定它们的18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。分子生物学的鉴定方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种, 而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加,近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛[10-17]。

对酵母菌鉴定最常用的分子系统发育分析方法有18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区等。酵母菌核糖体小亚基18S rRNA 存在不同保守程度序列的镶嵌现象(从高度保守到半保守区到高可变区)，使得该分子可以用来衡量较远的亲缘关系，也适宜于较近的亲缘关系。这个区域大约有1800bp，含有不同变异率的区段，可以用于种、属或更高等级分类群之间的系统关系研究[10-12]。酵母菌ITS区为核糖体内转录间隔区，位于18S rDNA 和26S rDNA 之间，包括ITS1 和ITS2 两个片断，中间包含一个5.8S rDNA 片段。ITS 区域与rDNA 转录区相比具有较高的变异率，对于亲缘关系较近的菌株间的区分是比较有效的。研究表明ITS 区域的差异大于1% 时就可能代表不同的种，然而对于不同的属而言，情况会有所不同[11-18]。26S rDNA 的 Dl/D2 区域位于大亚基的5'端，序列长度在600bp 左右，该段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究，目前已经成为酵母鉴定和系统发育分析的重要“标尺”。虽然酵母种内26S D1/D2 区碱基差异小于1%的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一个试验的经验值[11-13,19-20]。

本研究采用传统分离培养和分子生物学相结合，分离鉴定著名品牌山西水塔老陈醋大曲中酵母菌的种类，研究与老陈醋发酵产香等相关菌种，同时也为食醋传统工艺的研究、改造、纯种制曲等提供指导。

1材料与方法

1.1材料与仪器设备

1.1.1 样品和主要试剂

大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培养基购自北京博奥星。Dream Taq Green PCR Master Mix购自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR购自宝生物工程有限公司；其它试剂购自北京化工厂。

1.1.2 仪器设备

灭菌锅，无菌工作台，生化培养箱，摇床，分光光度计，荧光显微镜（重庆奥特光学），GeneAmp PCR System 2720(ABI)，ChampGel凝胶成像分析系统（北京赛智）。1.2 方法

1.2.1

培养基和样品制备

1.2.1.1 富集培养基

酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陈2%，调pH至4.5培养基灭菌后再加入链霉素（终浓度30 ug/ml）、青霉素（终浓度为50 ug/ml），孟加拉红0.033 mg/mL，以抑制细菌和霉菌生长。

1.2.1.2分离培养基

YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%。葡萄糖单独115℃灭菌15 min，然后加入培养基中，倒平板。1.2.1.3样品的处理

将曲块经过碾压研磨后混匀过40目筛，保藏在4℃冰箱中备用。

1.2.2

酵母菌的分离

将10 g曲粉加入100 mL无菌水中，在28℃ 200 r/min下摇20 min。取菌悬液3 mL接种于富集培养基中，培养48 h后吸取5 mL稀释涂布法分离，28℃培养2 d，观察菌落形态，配合镜检菌种细胞形态，2～3 次纯化后保存于4℃冰箱中。

1.2.3 菌种菌落形态和细胞形态鉴定

将酵母菌接种于YPD培养基中，培养3d后，观察菌落形态特征和细胞形态。1.2.4酵母菌菌株基因组DNA的制备

取菌种，按方法Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR说明书制备基因组DNA。提取后的基因组DNA作为扩增5.8S-ITS、18S、26S D1/D2区序列的模板。

1.2.55.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 区序列扩增

利用通用引物ITS1（引物序列：5'-ACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增。利用通用引物EF3（引物序列：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'）和EF4（引物序列：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增。利用通用引物NL-1（引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（引物序列： 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2 区扩增。在50 µl PCR反应体系中加入16 µl水、正向引物和反向引物各2 µl、5 µl 模版、25 µl Taq DNA聚合酶Mix。扩增程序：95℃变性5 min后，95℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min、共35个循环，72℃延伸10 min。电泳检测目的条带，扩增产物送北京理化分析测试中心进行测序。1.2.6 数据处理 将rDNA测序结果输入数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序与数据库中的序列进行比对分析。根据比对结果，找出与数据库同源性最高的已知菌种，推测待定菌株可能的属或种。

结果与分析

2.1酵母菌株分离结果和菌种菌落形态、细胞形态鉴定

从水塔老陈醋大曲中分离到优势酵母菌共21株。根据菌落形态特征和菌株细胞形态，将菌株进行初步分类，选取具有代表性的10株菌株，分别编号为M10、Q28、M12、Q13、M17、Q10、M25、Q34、Q7、Q12。其菌落形态与细胞形态见图1。

图1酵母菌细胞形态显微照片（1000×）和菌落形态

Fig.1 morphology under light microscope(1000×)and Colony morphology of yeast

2.2 分子鉴定结果

表1 5.8S-ITS测序比对分析

Table 1 5.8S-ITS sequence analysis of 21 yeast species 菌株

5.8S-ITS 测序比对分析

相似菌株 相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、Q3 M15、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain 3-1Y

100% 100%

Wickerhamomyces anomalus strain SX1 Pichia anomala strain CTSP F5 Clavispora lusitaniae isolate GK11 Issatchenkia orientalis strain zhuan 1.2 Pichia kudriavzevii clone STA197lsu

99% 100% 99% 99% 99%

表2 18s测序比对分析

Table 2.18s sequence analysis of 21 yeast species

菌株

18s 测序比对分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain NRRL Y-1871 Saccharomycopsis fibuligera strain NRRL Y-2388

Wickerhamomyces anomalus strain TIBx229 Clavispora lusitaniae strain NRRL Y-11827 Candida ontarioensis strain BC 2A Pichia kudriavzevii isolate EM12 Issatchenkia orientalis

100% 99%

99% 99% 99% 99% 99%

表3 26S D1/D2测序比对分析

Table 3.26S D1/D2 sequence analysis of 21 yeast species

菌株

26S D1/D2 测序比对分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q27、Q19 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2 Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1 Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028(G-1)Pichia kudriavzevii strain DMic 113897

Kluyveromyces marxianus strain IMAU4Y089(QH27-4)

Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005

99% 100% 100% 99% 99% 99% 99%

根据测序结果，鉴定到2株弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii strain BZR42，M10、Q28），8株扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2，Q6、Q33、Q25、M11、M26、Q10、Q14、M17），6株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1，Q3、Q13、Q27、Q19、M15、M12），3株葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028，M25、Q2、Q34），2株东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis strain IMAU3Y005，Q7、Q12）。结论和讨论

本研究按照酵母菌的富集分离培养方法分离山西老陈醋大曲中的酵母菌，利用形态学菌落形态和细胞形态初步鉴定为酵母菌。

利用通用引物ITS1和ITS4以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增，扩增到了酵母菌5.8S-ITS长度为350-650 bp。利用通用引物EF3和EF4以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增，扩增到酵母菌的18S长度为1500 bp左右。利用通用引物NL-1和NL-4以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2 区扩增，扩增到酵母菌的26S D1/D2 区长度为500-600 bp。成功扩增了21株的酵母菌的5.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 区序列，并进行了测序，测序结果与数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/进行了比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。

本研究发现5.8S-ITS序列、18S、26S D1/D2区在鉴定弗比恩酵母，扣囊复膜酵母，葡萄牙棒孢酵母，鉴定结果与模式菌种相识度高并且结果唯一。在鉴定Q3等菌种时，NCBI数据库中库比对结果与异常威克汉姆酵母、异常毕赤酵母相识度均为99%，不易鉴定最后是哪种菌。异常威克汉姆酵母，异常毕赤酵母，异常汉逊酵母，这三种酵母是同物异名，但最新的酵母分类学表明部分异常毕赤酵母更名为异常威克汉姆酵母[20]。在鉴定Q7等菌种时，与东方伊萨酵母、德里阿兹威毕赤酵母、马克思克鲁维酵母相识度均为99%，不易鉴定最后是哪种菌。东方伊萨酵母和库德里阿兹威毕赤酵母也是同物异名，最新的分类学名称是东方伊萨酵母。本文研究中发现，鉴定Q7菌种26S D1/D2区时，BLAST 比对结果与100个提交的基因序列，相识度在99%-100%，GenBank 数据库中酵母菌生物部分 rDNA 序列多、乱，但完整的基因组序列仅有模式种酿酒酵母和弗比恩酵母。目前公共核酸序列数据库酵母菌其它模式属和模式种还存在数据不完整的问题。因此新增并完善已发现的酵母菌相关序列数据信息，建立一个准确、精简、完整的酵母菌序列参照数据库显得十分必要。

本研究对酵母菌鉴定中最常用的分子系统学方法鉴定结果进行比较得出：它们的鉴定结果相互印证，可以确认鉴定的结果。本研究通过最常用的分子系统发育学方法，即5.8S ITS、18S、26S rDNA D1/D2 区序列分析及GenBank 查询和BLAST 比对，对分离自山西老陈醋酿造用大曲分离到的21株酵母菌进行了分类鉴定，同时比较了它们在鉴定结果上的异同。本研究鉴定到8株扣囊复膜酵母，颜华等研究表明利用扣囊复膜酵母进行生物发酵，直接将淀粉加工成人们所需要的各种产品而无需液化、糖化，可节约能源、降低成本，将具有深远的意义。而且，扣囊复膜酵母较传统的酿酒酵母来说，具有更丰富的次生代谢[20]。分离到的几种酵母菌将进一步进行发酵实验，测定发酵后产生的醇类、酯类及老陈醋特征型指纹图谱物质[1, 7, 9, 10, 22, 23, 24]。

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Super-vinegar Daqu Abstract: Daqu is the main raw material of the fermentation of Shuita Super-vinegar.It is rich in many microorganisms.The research on the composition of yeasts in Daqu has important directive significance for the fermentation of Super-vinegar.The 21 yeast strains are purified by traditional method which includes enrichment,dilution,coating etc.They are researched

by

morphological

observation

and

microscopic

examination.Their 5.8S-ITS,18S,26SD1/D2 domain sequences are amplified and measured to identify these strains in molecular taxonomy.The result of sequencing is intercompared with the known sequences in GenBank.It shows that these strains include 2 Cyberlindnera fabianii strains,8 Saccharomycopsis fibuligera strains,6 Wickerhamomyces anomalus strains,3 Clavispora lusitaniae strains,2 Issatchenkia orientalis strains.There are many yeast strains in Daqu.Their isolation,culture,identification in the molecular biology is the basis for culturing purified strain Daqu.Keyword:Daqu,Yeast,isolation,identification

第五篇：酸奶菌种的分离及鉴定

酸奶菌种的分离及鉴定

乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。

目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。

保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低 pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。

嗜热链球菌（S.thermophilus）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。

本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。

一、实验内容

（1）乳酸菌的分离纯化

1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养

2．菌落观察与镜检 3．筛选生产用菌株（2）优化酸奶制作条件

1．制备发酵液

2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产 3．观察发酵情况

4．品尝发酵产品，进行质量评价 5．记录结果

二、实验器材

1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）

2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；

0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g

香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；

3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸

四、实验方法

4.1乳酸菌的分离纯化 4.1.1分离

(1)配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。

BCG牛乳培养基配制

A溶液：脱脂乳粉100g,水500ml，加入1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）

B溶液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，PH6.8，121℃湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。（2）样品的处理

按照无菌操作要求，从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样，放入装有90ml无菌水的三角瓶内，振摇混匀。（3）分离方法 ①倒培养基

在无菌室，先用紫外线照射半小时把表面菌灭了，在通风10min后，每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基，立即放在桌上摇匀，冷却凝固后即成平板。②十倍稀释法

将检样充分摇匀后，用十倍稀释法稀释成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-5各种稀释度的样品液。目的是为了确定哪个稀释度最适宜。一般在培养基上长处50-300个菌落的稀释度为最佳。③分离

在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离，每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。4.1.2鉴别

（1）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。

（2）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用 4.2优化酸奶制作条件（1）乳酸菌培养基的制作

将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。即脱脂乳14.3g，无菌水100ml，蔗糖6g。（2）接种

将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种等量混合菌液作为发酵菌剂，均以2～5%的接种量分别接入培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的发酵液重复分装12瓶，将瓶盖拧紧密封。（3）发酵

将接种后的酸乳瓶置30℃，36℃和42℃培养箱中培养2或4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清晰出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。（4）发酵产物鉴定——纸层析法 将分离的纯菌种接种到乳酸菌葡萄糖发酵培养基上，40℃培养48h。取产酸不产气的液体试管中发酵液做纸层析。展开剂：水30mL、苯甲醇150mL、正丁醇150mL、甲酸3.3mL。显色剂 ： 将1.6%的溴酚蓝酒精溶液用0.1 mol／L的 NaOH调pH到6.7。显色后，分别测定发酵液与2%标准乳酸的Rf值，确定发酵产物中是否有乳酸

五、预期结果

1．分离鉴定获得嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌

2．获得酸奶制作的最佳条件

六、实验进度