第一篇：分子生物学方法推测年龄研究进展
【摘要】在人体的各种组织、器官中，d型／l型天冬氨酸的比值，碱基加合物和正常碱基的含量，染色体
末端端粒的长度，随着年龄的变化而变化。因此，可以用分子生物学方法准确推测年龄。
【关键词】d型／l型天冬氨酸，碱基加合物和正常碱基，端粒，分子生物学，年龄
【中图分类号】13919．2；07
5【文献标识码l a
【
文章编号】1007—9297(2003)01—0040—0
2在法医学实践中，经常需要对无名尸体、组织碎块进行
年龄估计。一般情况下应用法医人类学方法对牙齿、骨骼
等检材估计个体年龄。而在很多情况下，现场仅有组织碎
块存在，或者有的部位的骨骼不适合精确估计年龄，在这种
情况下用分子生物学方法估计年龄，尤为重要。体内的许
多物质随着年龄的变化而发生改变，目前有几种物质随着
年龄的改变而发生变化，一种是质的变化，一种是量的变
化。
胶质原存在于人体的各种组织、器官中，胶质原含有d
型、l型天冬氨酸。尤其在牙釉质、牙本质中，d型、l型天
冬氨酸的含量随着年龄的增加会发生改变，d型天冬氨酸
随着年龄的增加而增加，而l型天冬氨酸随着年龄的增加
而发生消旋作用，转变为d型天冬氨酸而含量下降。d型／
l型天冬氨酸的比值随着年龄的增加而增加。在牙本质中
这种变化较稳定，适合于用d型／l型天冬氨酸估计个体的年龄_1 j。国外许多学者建立了利用天冬氨酸的消旋作用
推测年龄的方法。2001年，pilin等利用此方法计算15～9
5岁之间的样本，年龄与d／l型天冬氨酸的比值的关系，其
相关系数达到0．93。此方法的优点在于当牙齿的形态遭到
严重破坏时，可以利用牙本质中天冬氨酸的稳定性来估计
个体年龄。此方法在实际应用中，水解蛋白质和手性分离、检测氨基酸的衍生物尤为重要，影响结果的准确性，可应用
gc、hplc、毛细管电泳进行手性分离和检测ll。
随着年龄的增长，人体的体细胞线粒体产生的自由基
增多，自由基的增多会对dna产生损伤。尤其活性氧弓l起的dna氧化性损伤，导致碱基结构的损伤，进而引起dna
在体内复制时发生突变。自由基对核dna和线粒体dna
都会产生损伤，由于线粒体dna没有组蛋白和hmg蛋白的保护，更容易产生损伤【6-8。活性氧对dna的损伤，表
现在dna的碱基形成加合物，在复制过程中，这些碱基产
生错配，导致突变。活性氧是结构最简单、稳定性最差、氧
化性最强、与四种碱基的反应活性最强的自由基，因此在细
胞中最多见的是活性氧导致的碱基损伤，活性氧攻击碱基的不饱和键形成碱基加合物。人体也存在抗自由基损伤的修复能力，但随着年龄的增加，修复能力下降。活性氧可和
碱基形成8一oh—g、5一oh—dg、5一oh—du、8一oxo
— da，dug、2一oh—da碱基加合物_6 j。通过对动物细
胞和体外培养细胞的研究，发现随着年龄的增长细胞的碱
基加合物含量会增加，其中8一oh—da、8一oh—g含量
最多。检测碱基加合物和正常碱基的含量，可用于推测个
体的年龄，但这种方法只能粗略估计年龄，适合于组织碎块的年龄估计。
在人类染色体的末端存在端粒，端粒由蛋白质和dna
组成，真核生物的线型染色体都存在端粒。端粒dna不存
在蛋白质编码基因，端粒基本由六核苷酸核心重复单位
(111aggg)组成，其中有的重复单位存在变异，重复序列问
亦存在一些插人序列。端粒虽然不存在功能基因，但端粒
起着稳固基因组、保护染色体末端、决定核内染色体定位作
用及调控体细胞复制作用l9。由于端粒调控着体细胞的分裂、复制，体细胞分裂、复制有一定复制生命周期，端粒
决定体细胞分裂次数，可以说是细胞分裂的“生物钟”，因为
端粒不能进行半保留复制，其复制依赖于端粒酶的存在。
大部分体细胞不存在端粒酶，体细胞每分裂一次，端粒就丢
失一段，随着细胞分裂而不断缩短，因而端粒的长度反映细
胞复制历史。也可以说端粒长度随着个体的年龄变化而缩
短，反映生物个体的年龄变化。而端粒长度的变化不受体
法律与医学杂志2003年第1o卷(第1期)
外因素的影响。细胞每分裂一次，不同的细胞缩短的长度
不同，因此端粒长度可以作为推断年龄的一个理想标
记[1卜15]。
端粒长度的检测方法目前有trf(末端限制性片段
法)、fish(荧光原位杂交法)、a(杂交保护法)等。这些
方
法检测都是46条染色体端粒的平均长度，而不同染色体的端粒长度存在差别，以及同一染色体的两个端粒亦存在差别[16]。通过检测平均长度而推测年龄，误差较大。如果
能准确检测一个端粒的长度，推测年龄准确性将大大提高。
随着分子生物学和分子遗传学及相关技术的发展，用
分子生物学方法可以准确推测个体的年龄。
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(收稿：2o02一l1—06)
第二篇：甘油生产方法研究进展
甘油生产方法研究进展
甘油又称丙三醇，分子式C3H5(OH)3，是一种粘稠液体，有甜味，所以称为甘油；能与水以任意比混溶，有强烈的吸湿性，是重要的基本有机原料。1779年，瑞典化学家谢勒(Scheele)偶然从橄榄油与一氧化铅的反应中获得了甘油，这是人们第一次知道甘油的存在。
·
最早，人们只将甘油作为皮肤的滋润剂，至1846年，沙勃里罗(Sobrero)将甘油与硝酸反应，得到硝化甘油。20年以后，诺贝尔将硝化甘油与硅藻土制成了安全炸药，使硝化甘油能顺利地应用于达纳炸药的生产。现在，甘油的用途已经十分广泛，主要用于医药、化妆品、醇酸树脂、烟草、食品、饮料、聚氨基甲酸酯、赛璐珞、炸药、纺织印染等方面。大约有1700多种用途。
由于石油等不可再生能源的日益消耗，寻找清洁的可再生能源成为化学工作者义不容辞的责任，甘油，来源于自然界，无毒无害，是理想的化工原料。因此，如何很好地开发甘油，发现它的新用途成为研究热点。本文对甘油的生产方法作一个综述，希望对致力开发甘油新用途的化学工作者有所帮助。
甘油主要以甘油酯的形式广泛存在于自然界中。所以，长期以来，大部分甘油是从油脂皂化生产肥皂以及从油脂水解产生脂肪酸的过程中作为副产物取得的。直到1858年，人们才知道用发酵法也能制甘油。第一次世界大战时期的德国，由于甘油缺乏，首创用甜菜发酵制甘油。从1948年起，用丙烯合成甘油的方法已开始在工业上应用，产量逐年上升，发展趋势较快。现在，甘油的工业生产方法按甘油的来源可以分为3类，即天然甘油的生产，发酵甘油的生产，合成甘油的生产。其中前2类方法的原料都是可再生的。1 天然甘油的生产
主要来自肥皂生产和油脂裂解过程的副产品；1948年以前，甘油全部从动植物油脂制皂的副产物中回收。直到目前，天然油脂仍为生产甘油的主要原料，其中约42%的天然甘油来自制皂副产，58%来自脂肪酸生产。
由于该方法以天然油脂为原料，且甘油是副产物，我国的化学工作者设想将其用于油脚的废水处理和利用上，既起到环保的作用，又得到一定的经济效应。如葛文光利用棉油脚生产脂肪酸后的废水回收甘油。安徽省应用技术研究所的冯立文等发表了动植物油脂及油脚生产油酸、甘油、硬脂酸、聚酰胺树脂的技术论文。国家脂肪酸技术研究推广中心的汪习生等介绍了《国家级科技成果重点推广计划》高效益环保项目”利用餐饮泔水油及废动植物油生产油酸、甘油、硬脂酸”新工艺。1.1 皂化甘油
皂化反应产物分成2层：上层主要是含脂肪酸钠盐(肥皂)及少量甘油：下层是废碱液，为含有盐类、氢氧化钠的甘油稀溶液，一般含甘油质量分数9%-16%，尤机盐质量分数8%-20%。
目前阔内提取甘油工艺主要采用传统蒸馏法，即将皂化废液经过澄清处理得到精废液，接着浓缩为质量分数40%的甘油，回收盐后浓缩为质量分数80%的甘油，再真空蒸馏、活性炭处理、压滤得到甘油产品。该法存在着产品质量低和能耗高等缺点，致使我国的低级甘油过剩，而98%以上的皂化或药用级甘油，尤其是99.9%的高纯度甘油，主要靠进口。
梁秉华等在采用传统工艺制得质量分数40%的甘油后，提出新的工艺流程。首先采用阳离子型高离子澄清剂进行中性条件下的第2步澄清处理，减少了副反应，除色和除臭效果好；第2步为色谱分离，使离子物和非离子物的盐、胶体和有色物从甘油中排除；最后进行树脂脱色、脱盐和真空浓缩，制得高纯度甘油。整个生产过程在100℃下进行，浓缩阶段也在110℃下进行，杂质少、能耗低，可制得低成本相当药用二级甘油。并且小试和中试对比了新、旧工艺在质量、技术经济指标和环保方面的特点和优势。分析了工业化规模的可行性 1.2 油化甘油
油化甘油指的是用油脂水解法生产的甘油。油脂水解的主产品是硬脂酸、油酸等油化产品，甘油是副产品。油脂水解得到的甘油水，其甘油含量比制皂废液高，质量分数约为14%-20%，无机盐的质量分数0%-0.2%。近年来已普遍采用连续高压水解法，反应不使用催化剂，所得甘油中一般不含无机酸，净化方方法比处理废碱液简单。我国油化甘油生产能力已突破万吨。
无论是制皂废液，还是油脂水解得到的甘油水所含的甘油量都不高(质量分数10%左右)，而且都含有各种杂质。所以，需要净化、浓缩的过程先得到粗甘油，然后将粗甘油进行蒸馏，脱色、脱臭的精制过程才能得到天然甘油。2 合成甘油的生产
从丙烯合成甘油的多种途径可归纳为2大类，即氯化和氧化。现在工业上仍在使用丙烯氯化法及丙烯过乙酸氧化法。2.1 丙烯氯化法 这是合成甘油中最重要的生产方法，共包括4个步骤，即丙烯高温氯化成氯丙烯、氯丙烯次氯酸化成二氯丙醇、二氯丙醇皂化得环氧氯丙烷以及环氧氯丙烷水解成甘油。2.2 丙烯过乙酸氧化法
丙烯与过乙酸作用合成环氧丙烷，环氧丙烷发生异构化为烯丙醇，然后在过乙酸氧化下生成环氧丙醇(即缩水甘油)，水解生成甘油。或者烯丙醇在双氧水氧化下直接生成甘油。
过乙酸的生产不需要催化剂，乙醛与氧气气相氧化，在常压、150-160℃、接触时间24s的条件下，乙醛转化率11%，过乙酸选择性83%。
上述后2步反应在特殊结构的反应精馏塔中连续进行。原料烯丙醇和含有过乙酸的乙酸乙酯溶液送人塔后，塔釜控制在60-70 ℃，13-20KPa。塔顶蒸出乙酸乙酯溶剂和水，塔釜得到甘油水溶液。此法选择性和收率均较高，采用过乙酸为氧化剂，可不用催化剂，反应速度较快，简化了流程。生产每吨甘油消耗烯丙醇1.001 t，过乙酸1.184t，副产乙酸0.974t。2.3 环氧氯丙烷法
用环氧氯丙烷合成的甘油，是一种工艺成熟、产品质量好的生产方法。1980年我国就引进了生产装置，目前我国合成甘油的年产能力在5kt以上，但长期以来受原料环氧氯丙烷货紧价高的影响，使合成甘油的生产能力尤法发挥。国外合成甘油产量很大，美国年产甘油300kt，其中合成甘油150kt。
在环氧氯丙烷生产中，产生大量副产品三氯丙烷，可综合利用，通过加热水解制各甘油。
(1)水解。在反应养内加入1 mol三氯丙烷副产品(混合物，沸程130-170 ℃)，加热回流，滴加醋酸钠水溶液(醋酸钠用量是三氯丙烷质量的3%)，滴完后即开始滴加1.5 mol的质量分数20%氢氧化钠溶液，滴加时间约为2h，回流温度由100℃左右逐步因共沸作用而降低到900℃左右，此后，因水解作用沸点逐步上升，直到110℃为止，(在滴完后约1 h)，抽样观察。反应物中油相消失，由二相变为一相，在110℃保持10min后，并在搅拌中逐步降温到70℃后继续搅拌1 h，开动真空泵，脱气10min，然后在常压条件下加热到85 c℃放料，用盐酸中和到pH为6为止，冷却。
(2)甘油水的纯化。经中和的产品是甘油水的饱和食盐溶液，加入少量多聚氯化铝净水剂，静置过夜，过滤去除不净杂质，去除表层浮油，如有结晶盐析出，必须用少量清水洗除盐表面所吸附的甘汕，再把洗液过滤后和第一次的滤液合并。所得产品为浅黄色的甘油食盐溶液。
(3)脱盐。把以上所制的产品在真空中(6.666-10.666kPa)脱水，沸点约50-60 ℃，当水馏出量约为总体积的1/6时，即把残液过滤脱盐，滤出的盐分必须先用未浓缩的甘油溶液来洗涤，再用淡水洗涤，洗液和浓缩液合并，重新真空蒸馏脱盐，如此反复5-6次，直到浓缩液中甘油的质量分数达80%以上，即可用为粗甘油处理。
(4)离子交换处理。把粗甘油用水稀释到质量分数20%左右，先用阴阳离子混合的离子交换柱处理，然后依次用阴离子树脂，阳离子树脂处理，如此反复3次，待甘油溶液中不含氯离子或钠离子，即可得去离子甘油水溶液。
(5)浓缩和蒸馏。把上述的甘油水溶液在13.332kPa，60℃左右浓缩到质量分数91.3%，用氢氧化钠把pH调节到8.5，然后在933.254h，170℃进行蒸馏，可得纯度在98%以上的纯甘油。
将天然油脂水解法和环氧氯丙烷法原料消耗作一粗略的对比，不难发现天然油脂水解法的优势，天然油脂水解法用的原料是肥皂废液，没有规格要求，价格便宜”习。就生产甘油总消耗的原料来看，天然油脂水解法也比环氧氯丙烷的要少。而且，合成法制甘油的设备投资大，成本又较高。然而，随着人们生活习惯的改变，肥皂的广阔市场逐渐被洗衣粉、洗涤剂等占领，肥皂的生产随之萎缩，肥皂废液回收甘油产量也相应减少。所以，许多化学工作者又将发酵法生产甘油作为努力的方向。3 发酵甘油的生产
利用淀粉类原料(谷物、玉米、红薯等)或糖蜜原料，经微生物发酵而产生。
我国研究发酵法始于20世纪50年代中期，从60年代兴起的耐高渗透酵母菌种的研究和应用到70年代处于鼎盛时期，到1994年至1995年，开始进入工业生产，特别是山东、江苏、甘肃等地的企业较多。
为了解决当时有的工厂因发酵周期长、产甘油率低而停产的情况，李亚东等，采用回用酵母发酵生产甘油，以期缩短发酵周期，提高产甘油率、减低残糖含量。2001年，唐军等作了采用Candida krusei的分批培养与补料分批培养生产甘油的探索。2003年，刘听等做了以蜜糖为原料利用耐高渗透压酵母生产甘油的研究。2005年，刘桂香等研究了利用邑蕉芋葡掏糖浆发酵生产甘油，降低发酵法生产甘油的成本。
1993-1994年，国内城乡企业以酒糟土生产复合甘油。酿酒的发酵醪液中，经分析含有质量分数约1.8%-3.5%的甘油成分，当蒸馏出乙醇后，所剩的酒糟巾即含行甘油。但所谓的从酒糟中生产甘油，并不是指这部分甘油，而是在酒糟中还含有未完全转化为乙醇的淀粉及其中间产物(质量分数约8%-10%)，利用这部分淀粉经糖化、催化发酵处理，生成甘油的方法。
以酒糟生产复合甘油工艺原料易得、成本低，但质量达不到要求，至1995年大部分企业停产。但是因该方法原料来源丰富，价格便宜，且绿色环保，我国化学工作者从未放弃对它的研究。许金木、熊联明等研究了利用酒糟来生产复合甘汕，以期代替甘油。然而，从酒糟中生产复合甘油巾于质量不高，用途很窄，不能完全代替精甘油。因此，化学工作者义对制精甘油的工艺进行了研究。其中，喻雪英等对废酒糟生产精甘油做了一些尝试。相信在不久的将来，此方法将会大大缓解我国甘汕紧张的局面。4 结束语
甘油是油化学产品的重要副产品，又是其它化学产品的重要原料，主要用途有医药、化妆品、香烟、炸药及食品。随着我国国民经济的不断发展，作为国计民生重要化工产品的甘油市场需求量不断增长，尤其是在涂料、化妆品工业和医药工业的需求在逐年增加。因此，开发国内甘油的生产和应用，对我国石油化学工业的发展意义重大。
第三篇：DNA甲基化与个体年龄的相关性研究进展
【摘 要】年龄推断在法医实践中占有重要的地位。分子生物学的巨大进展使得人们借助于生物学标记推断个体年
龄成为可能。作为表观遗传学重要组成部分的dna甲基化，在机体生长、发育、衰老的过程中存在着动态变化过程．通过
检测dna甲基化改变，有望构建与之相关的年龄变化模式，用以推断个体年龄。本文着重介绍dna甲基化水平的改变与
个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景。
【关键词】法医物证；dna甲基化；年龄推断；生物体衰老
【中图分类号】d9l9．
2【文献标识码】a
【文章编号】1007—9297(2006)04—0284—0
5当前在法医学实践中，对个体年龄的推断主要是
依据人类学方法测量骨骼、牙齿等一些具有年龄相关
性的检材．并根据相关模型进行计算。分子生物学的飞速发展，开拓了人们的视野。借助于分子生物学理
论和方法．在细胞水平、分子水平发现一些可能与年
龄相关的遗传学改变，如dna损伤修复能力、端粒的长度、线粒体片段的缺失、dna甲基化水平、b一半乳糖
苷酶活性以及基因表达谱等。lll dna甲基化是表观遗
传学(epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞
功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重
要作用．在衰老的过程中某些细胞会发生年龄相关的变化，121例如某个cpg岛的从头甲基化会关闭一个基
因，使这个基因相关的生理功能丧失：同样。甲基化的丢失也会激活正常情况下沉默的基因．造成不恰当的异位表达(ectopic expression)。必须指出，表观遗传研
究丝毫没有降低遗传学或基因组学的重要性，恰恰相
反，表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基石的经
典遗传学和分子遗传学母体中孕育的专门研究基因功
能实现的一种特殊机制的遗传学分支学科。认识到表
观基因组在发育、生长和衰老过程中存在着一个动态
变化的过程，以及体细胞的表观基因组有重新编程的可能性，有助于我们以新的观点来探索衰老的机制，构
建年龄变化的模式。本文就dna甲基化与个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景进行探讨。
一、概述
(一)表观遗传学和dna甲基化
遗传学是与表观遗传学(genetic)相对应的概念。
遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变
化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而
表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表
达水平变化，如dna甲基化和染色质构象变化等：表
观基因组学(epigenomics)~0是在基因组水平上对表观
遗传学改变的研究。甲基化是最重要的表观遗传修饰
形式。dna甲基化是生物体在dna甲基化转移酶
(dnmts)的作用下，以s一腺苷酰一l一甲硫氨酸(sam)
为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程，dna甲基化多发生在胞嘧啶，大多在一cpg一序列上。
胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine．
5-mc)。这种dna修饰方式并没有改变基因序列。但
它调控了基因的表达。
哺乳动物中．cpg序列在基因组中出现的频率仅
有l％，远低于基因组中的其他核苷酸序列。但在基因
组的某些区域中，cpg序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区．形成所谓
cpg岛。通常cpg岛大约含有500多个碱基。在哺乳
动物基因组中约有4万个cpg岛，而且只有cpg岛的胞嘧啶能够被甲基化，cpg岛通常位于基因的启动
子区或是第一个外显子区。人类基因组中大小为
100～l 000 bp左右且富含cpg二核苷酸的cpg岛总
是处于未甲基化状态．并且与56％的人类基因组编码
基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类
基因组cpg岛约为45 000个．大部分染色体每1 mb
就有5—15个cpg岛。平均值为每mb含lo．5个cpg
岛，cpg岛的数目与基因密度有良好的对应关系。健
康人基因组中．cpg岛中的cpg位点通常是处于非甲
基化状态，而在cpg岛外的cpg位点则通常足甲基化的。这种
甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。阁基因
调控元件(如启动子)所含cpg岛中的5-mc会阻碍
[作者简介]李鑫(1974一)，男，山东淄博人，主检法医师，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究。
法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期)
转
录因子复合体与dna的结合，所以dna甲基化一
般与基因沉默(gene silence)相关联；而去甲基化
(demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(re．
activation)相关联。当机体衰老或呈病理状态，特别是
肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲
基化程度增加，而cpg岛中的cpg则呈高度甲基化，以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。
一般说来，dna的甲基化对维持染色体的结构、x染
色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。【6】
(二)dna甲基化的生物作用及特点
1．dna甲基化与基因表达
dna甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚
胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研
究表明胚胎的正常发育得益于基因组dna适当的甲
基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。[31此外，等位基因的抑制被印记控
制区(icrs)所调控，该区域在双亲中的一个等位基因
是甲基化的。17]印记基因的异常表达可以引发伴有突
变和表型缺陷的多种人类疾病。甲基化抑制基因转录
主要通过以下机制来实现。
(1)直接抑制。cpg岛甲基化真接干扰tf与调控
区dna 的结合． 例如camp反应元件结合蛋白
(creb)，ap一2，e2f，nfkb等tf不能与相应的dna
位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲
基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体
内tf与dna相结合。
(2)间接机制。近年来发现一些甲基化dna结合蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化cpg结合蛋白如
mecp1，mecp2与甲基化dna特异结合，抑制基因转
录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动
子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动
子，但对强的启动子则收效甚微。
(3)dna甲基化还可通过影响染色体结构来抑制
转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起
始转录，而且mecp1与甲基化启动子cpg位点结合后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转
录因子不能与其相结合，从而抑制转录。
dna甲基化状态并非固定不变．在许多哺乳动物
组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、心脏和脾脏内发现dna脱甲基化作用。相反，大鼠肺
则不发生脱甲基化，大鼠。肾内甲基脱氧胞苷总含量增
加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化
· 285 ·
和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行
性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基
因表达变化。
2．dna甲基化与肿瘤的关系
研究表明，dna甲基化在肿瘤的发生、发展中起
重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要
因素，这种变化包括dna甲基化总体水平降低和启
动子等基因表达调控元件附近的cpg岛局部甲基化
水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色
体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表
达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的几率提高，例如：胰岛素
样生长因子一2(igf一2)基因印记丢失导致多种肿瘤，如wilm‘s瘤。【8j
3．dna甲基化与基因印记
基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这
种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心
来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异
性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个．而使另
一个沉默。基因组印记是可遗传的，dna的甲基化在基因组印记的分子机理中充当重要角色。dna高甲基
化是一个基因印记抑制信号，dna甲基化对控制印记
基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作
用。[9
14．人类基因组dna甲基化的特点
dna甲基化的基本特征有：1)数量多、信息容量
大；2)可遗传性：有丝分裂时分化细胞可以稳定地将
甲基化模式传递给子代细胞：3)相对稳定性，即在体
内．内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化
谱的改变；4)与snp标记毗邻，提供不同层次信息，相
互补充。人类基因组dna甲基化还有自身特点。
(1)时空特异性。dna甲基化是记录细胞分化历
史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学
者认为，dna甲基化可能使分化细胞基因组重新编
程，通过dna 甲基化来控制基因的时空表达，调节发
育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段，基因组dna上各cpg位点甲基化
状态的差异构成基因组dna甲基化谱。组织特异的dna甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。
细胞之间dna甲基化模式的差异是在个体发育的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不
变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向
发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组
· 286 ·
织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组dna甲
基化总体水平不断下降．特定dna片断的甲基化程度
可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。
(2)亲缘特异性。在某些基因座，所有组织体细胞
都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化．呈现亲缘
依赖的等位基因甲基化模式。
(3)病理特异性。在病理状态下，组织细胞的dna
甲基化谱发生特异性的改变。dna甲基化改变在许多
肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启
动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。
二、dna甲基化与年龄相关性
分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。
然而，在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变
化。例如，某种cpg岛的从头甲基化会关闭一个基因，丧失与这个基因相关的生理功能；同样．甲基化的丧
失也会激活正常情况下沉默的基因，造成不恰当的异
位表达。2o世纪8o年代初，wilson等测定了体外培养的人、田鼠及小鼠成纤维细胞dna的5 甲基胞嘧啶
含量，发现均随细胞分裂次数的增加而降低．且下降
速度以人、田鼠、小鼠的次序递减．而永生化细胞系的甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以dna甲基化
酶抑制剂5 氮杂胞苷或5 氮脱氧胞苷处理人二倍
体成纤维细胞或某些肿瘤细胞，可使其增殖能力下
降，体外培养寿限缩短。因此，dna甲基化水平也可以
作为细胞分裂的“计时器”。体内实验同样发现基因组
整体甲基化水平有随龄降低的趋势。
在基因组整体甲基化水平降低的同时，衰老过程
中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。最早证明
与年龄相关启动子cpg岛的甲基化是人结肠组织雌
激素受体(estrogen receptor，er)基因，年轻个体中，几
乎检测不到er基因的甲基化，以后，随龄逐渐升高。
另外。胰岛索样生长因子2(insulinlike growth facror，igf2)、肌原调节蛋白myod1、体觉诱发电位组分
n33基因启动子cpg岛的甲基化水平在正常的结肠
组织中同样随龄升高。tra等用限制性界标基因组扫
描技术对t淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变
化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中2
3个增加，6个降低。也许．这些特定基因的甲基化是更
好的衰老生物学标志。
陈培利等_10]利用人胚肺二倍体成纤维细胞(hu
man fetal lung diploid fibroblasts。2bs)进行体外培养。
发现其p16基因启动子区及外显子i处的dna甲基
化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将
2bs细胞在体外作常规传代培养(规定3o代龄以内为
法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期)
年轻细胞，55代龄以上为衰老细胞，在31至54代龄
之问位中年细胞)。然后用有机法提取细胞dna，取各
组dna各llxg加入sinai约40u，25~c酶切过夜(smai
不具备甲基化修饰作用)。然后对p16基因外显子i
及13-actin进行pcr扩增。
ll 二| ’。_ lll
l | _ __⋯一_l＼
‘l ＼_ _l' _li ＼
_l＼ il、l i、_ li 0_ _l
年轻细胞中年j田胞老年细胞
围1不同代龄2bs细胞p16外显于pcr扩增条带的吸光度扫描值【’。
寰1 不同代龄2bs细胞pl6外丑于l殛i~-actinpcr扩增条带的吸
光度扫描值
组别 n
沣：#以b—actin的值校正后结果；t检验，与年轻细胞相比，p 5实验结果(参见表1)表明，不同代龄2bs细胞 p16基因外显子i上的扩增产物均低于相对的未酶切的b—actin对照组，且其dna甲基化水平随代龄的增 加而趋于降低，在年轻细胞中甲基化水平约为64％． 而在衰老细胞中仅为24％，降低约40％。在之后的研 究中，陈培利等在以2bs为模型的衰老研究中发现，细胞分裂一次端区(即端粒)缩短50bp，抑制dna甲 基化则可导致细胞早衰。⋯】他们测定了去甲基化处理 后的2bs细胞的端区长度．研究表明老年2bs细胞衰 老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻 细胞则变化不显著。从而推断甲基化的改变可以影响 染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与dna的作用l1 1，后者可以进一步引起端区长度改变。 三、dna 甲基化检测方法 随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化 检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。 dna甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化 模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。甲基化 含量分析5mc在基因组中所占的总体比例：甲基化水1 8 6 4 2 0 l n n 璎辍 越 法律与医学杂志2006年第13卷(第4期) 平分析单个cpg胞嘧啶甲基化的发生率，若同时分析 多个cpg位点，则可以制作甲基化水平图谱；甲基化模 式分析一段单链dna上一组cpg的甲基化状态组合。 根据研究目的，甲基化检测方法分为：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化 位点。从研究所用的处理方法不同分为：基于pcr的甲 基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法； 基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。[31以下归纳 总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。 (一)基因组整体水平甲基化分析 高效液相色谱柱(hplc)及相关方法。hplc是一 种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平 dna甲基化水平。它由kuo等1980年[131首次报道。 过程是将dna样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光 测定吸收峰值及其量，计算5mc／(5mc+5c)的积分面 积就得到基因组整体的甲基化水平。oefner等199 2年提出变性高效液相色谱法(dhplc)用于分析单核 苷酸和dna分子。邓大君等2001年i141将其改进与 pcr联用建：立了一种检测甲基化程度的dhplc分析 方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增。 由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞 嘧啶，因此原甲基化的在pcr扩增时，其变性温度也 相应上升。使pcr产物在色谱柱中保留的时间明显延 长．这样就可以测定出pcr产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样 本检测．能够明确显示目的片段中所有cpg位点甲基 化的情况．但不能对甲基化的cpg位点进行定位。 其他基因组水平甲基化分析还有sssi甲基转移 酶法，免疫化学法，氯乙醛法等。各具优缺点。 (二)特异性位点的dna 甲基化的检测 1．甲基化敏感性限制性内切酶(ms—re—pcr／ southern)法 这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲 基化区的不切割的特性．将dna消化为不同大小的片段后再进行分析。这是一种经典的甲基化研究方 法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，实验结果易解释； 2．甲基化特异性的pcr(ms—pcr) herman等[161 1996年在使用重亚硫酸盐处理的基 础上新建的一种方法。它将dna先用重亚硫酸盐处 理。这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变。随后行引物特异性的pcr。检测msp扩增产 物．如果用针对处理后甲基化dna链的引物能扩增 · 287 · 出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对 处理后的非甲基化dna链的引物扩增出片段．则说明 被检测的位点不存在甲基化(见图2)。[15·17] ． ／ 5’衄_{2盈__平盈3． 5-啪__曩墨|_唧h _霉叠__甲3· — __． — p1．m ri 一 一 图2甲基特异性的pcr扩增(ms—pcr)示意i莩i。dna经重亚硫酸盐处 理后。以处理后的产物作为模板．加入甲基化特异性的引物(primer 1) 或非甲基化的引物(primer¨)．进行特异性的扩增(如图所示)，只有结 合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。[1s,1(三)寻找新甲基化位点 1．限制性标记基因组扫描(rlgs) costello等2000年报道的rlgs[ 81能对整个基因 组的甲基化状态进行分析．发现新甲基化基因的方 法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。 其过程是：先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶not i消化基因组dna，甲基化位点保留，标记末端、切 割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割。行二维电泳，这样甲基化的部分被切割 开并在电泳时显带，得到rlgs图谱与正常对照得出 缺失条带即为甲基化的可能部位。 2．联合甲基化敏感性限制性内切酶的mb(com． pare—ms) srinivasan yegnasubramaniant 91 2006年报道了一 种新方法compare—ms．该法将mbd柱层析法与 ms—re联用。互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感的检测dna甲基化情况(见图3)。[19j 四、甲基化型分析的优势以及存在的问题 (一)甲基化作为检测对象的优势 1．甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相 连的多种疾病相关的丰富信息。叉具有简单的“二元 化”性质，即令甲基化为“0”，非甲基化为“1”，就可以进 行数字化处理，便于开展大规模和自动化监测分析。 2．dna分子十分稳定。有可能将它和dna的snp 分析等置于同一个技术平台。同时它又比rna和蛋白 质更便于保存和运输。并可对已经石蜡、甲醛或乙醇预 · 288 · _f 簟 ● ● 图3 联台甲基化敏豫性限制性内切酶的mbd(compare-ms)示 意围。用甲基化以外的位点的内切酶ia酶)与甲基化敏雅的内切酶(b 酶)联用．则甲基化的dna链不被切开。非甲基化的切开．再行mbd 捕获存在甲基化位点的dna片段。最后行实时pcr扩增并分析。f删 处理的样本进行分析，可以开发历史上储备的病理学资 料。 (二)存在的问题 目前还未找到dna甲基化改变与年龄之间的精 确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基 因甲基化水平的改变有了初步的了解．但还在研究探 索二者之问的精确的量化关系。[201对使用dna甲基 化改变来推断个体年龄的大小，仍需要进行大量的研 究和调查。 (三)付诸于实践之前还必须解决的问题 1．确定表观遗传修饰与特定生理指标的相关性： 2证实将这些指标作为鉴别诊断的潜在可能性和 技术可行性： 3．通过一定规模的流行病学调查来验证实验室内的表观遗传生理及病理发现在人群中的真实性。 五、dna甲基化在法医学中判定个体年龄上的展 望 目前，研究dna甲基化水平改变与个体年龄的相关性尚处于试验阶段，但已引起许多学者的关注。 人类表观基因组协会(human epigenome con—sortium，hec)于2003年1o月正式宣布开始投资和实施人类 表观基因组计划(human epigenome project，hep)。 dna甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容，hep的最终目标是就要确认这些dna 甲基化位点在人类基因组的分布与频率，以指导和系 统研究dna甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因 印记等发挥的作用。借助于该计划的实施和分子生 物学技术的发展，在法医实践中可以通过调查各年龄 段人群基因组dna甲基化分布以及相关频率，建立 相关统计学模型，将来有望成为法医个体年龄判定的一项重要的生物学指标。(感谢西安交通大学医学院第一附 法律与医学杂志2006年第l3卷(第4期) 属医院妇产科、环境与疾病相关教育部重点实验室郑鹏生教授 和顾婷婷同学的支持和帮助。) 参考文献 【1 j 马宏，张宗玉，童坦君．衰老的生物学标志[j】．生理科学进展，2002，33：65—69 [2】陈朝飞，房静远．衰老的表观遗传修饰研究[j】．上海医学，2006，29 (1)：58～60 【3】dahlc，guldbergp．dnamethylationanalysistechniques[j】．biogerontology，2003，4(4)：233~250 【4 ] bird a p．cpg—rich islands and the function ofdna methylation[j]． nature，1986，321：209~231 【5 j depamphilis ml，zorbas h．identifying 5一methyic 08ine and related modifications in dna genomes[j】．nucleic acids res．1998，26(10)： 2255～2264 [6】 黄庆，郭颖，府伟灵．人类表观基因组计划[jj'生命的化学，2004，24 (2)：101~102 [7】董玉玮，侯进慧，朱必才，等．表观遗传学的相关概念和研究进展叨． 生命的化学，2005，22(1)：1~3 [8】feinberg a p，tycko b．the history of cancer epigeneticⅲ．nat rev 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置换及拌入法有换填垫层法、振冲置换法、高压喷射浆法、深层搅拌法、褥垫法等多种方法；采用砂、碎石等材料置换软弱土地基中部分软弱土体或在部分软弱土地基中掺入水泥、石灰或砂浆等形成加固体，与未被加固部分的土体一起形成复合地基，从而达到提高地基承载力减少沉降量的目的。 1.4加筋法 加筋法有加筋土法、锚固法、树根桩法、低强度砼桩复 合地基法、钢筋砼桩复合地基法等多种方法。通过在土层埋设强度较大的土工聚合物、拉筋、受力杆件等达到提高地基承载力，减小沉降，维持建筑物稳定。 以上方法的原理、适用范围及工程实例可参考殷宗泽、龚晓南主编的《地基处理工程实例》[2]一书。 2.软弱地基处理方法的选择 在地基处理中，我们要遵循的原则是：技术先进、经济合理、安全适用、确保质量[3]。可根据以下条件进行选择： 2.1地质条件 不同的方法适用于不同的地质条件，可参看规范。 2.2设计施工条件 设计时应考虑工期及用料情况：工期不宜安排得太紧；时间充分，施工时地基稳定性好，遗留问题少。工程用料要求就地取材。施工时应采用科学的管理方法。 2.3场地环境条件 要考虑施工时对周围环境的影响。如：新填土会挤压原有道路、房屋，产生侧向位移或附加沉降；用砂桩、砂井时，施工有噪声，靠近居民点会扰民；采用降低水位法时，要考虑引起周围地基的下沉和对周围居民用水的影响故应预先调查或做隔水墙，并考虑施工后注水复原的问题；采用填土堆载时要有大量的土料运进运出工地，会影响交通和环境卫生；打石灰桩、灌注药物或采用电渗排水时，会污染周围地下水，应慎重对待。 2.4结构物条件 要考虑结构物的等级、结构体系、断面形状、位置、埋深、使用要求和建筑材料等因素对所选择加固方法的影响，特别是有地下结构物（地下室、涵洞、地铁等），或者结构物高低不同、沉降不均时，应当特别注意。 3.地基处理技术的创新 近几年来，世界各地因地制宜的发展了许多新的地基处理方法。 3.1。添掺外加剂方面[4] 以前的地基处理方法大多从机械设备着手，从而建立某种工法，而从材料入手提高地基处理质量和效果的较少。高性能土壤固化剂土壤混合后，特别是与高含水量和富含有机 质的淤泥发生一系列物理化学反应，形成相互连接的网状结构，从而提高固化土的强度，减少地基变形。通过室内实验和现场试验证明，用高性能土壤固化剂作地基处理特别是对软弱地基的处理很有效，比普通水泥加固效果好的多，此项技术在国外应用已相当普遍已有很成熟的研究机构和公司，但在国内尚属起步阶段。 3.2综合应用水平方面 重视多种地基处理方法的综合应用可取得较好的社会经济效益。 真空预压法与高压喷射注浆法结合可使真空预压应用于水平渗透性较大的土层，而高压喷射注浆法与灌浆相结合使纠偏加固技术提高到一个新的水平[5]。 单用动力固结法(俗称强夯法)处理饱和软粘土地基时却极易产生“橡皮土”现象，难以达到预期效果。为此，岩土工程界将强夯法和排水固结法结合起来，开创了“动力排水固结法”这项新技术[6]。 3.3.可持续发展方面 我国《建筑地基处理技术规范》JGJ79—2002已经将粉煤灰正式列为换填垫层法可采用的一种垫层材料。 渣土桩又称“孔内深层夯扩挤密桩”，是一种新型地基处理方法，其充分利用建筑垃圾，变废为宝，施工现场干净无污染。 地基处理技术还被用于防止有害物渗出液污染地下水以及防止其他已被污染区域地下水的流动造成污染扩散。近期出现的处理新技术是让被污染的地下水通过含有将地下水中有害物变性、吸收及降解的铁屑或碳颗粒的活性截水墙PRB使地下水得到净化[7]。 4．结语 我国地基处理技术发展很快，但还有许多方面需进一步研究： （1）发展现场监测技术的研究。 （2）发展测试技术的研究 （3）促进地基处理理论方面的进一步发展。 （4）完善工法的质量检验手段。 （5）发展地基处理新技术，提高地基处理技术的综合应用水平的研究。 （6）要因地制宜合理选用处理方法。正确评价各种地基处理方法的适用性。 （7）研制新机械新材料，提高施工工艺，实现信息化施工的研究。 （8）深化施工管理体制改革，重视专业施工队伍建设。 参考文献 [1]顾晓鲁,钱鸿缙,刘惠珊,汪时敏.地基与基础[M]北京:中国建筑工业出版社,2003,(15):576 [2]殷宗泽,龚晓南地基处理工程实例[M]北京:中国水利水电出版社,2000(1):14~17 [3]陈莞尔软弱地基加固方法的合理选择[J]地基基础,2004 [4]於春强,郑尔康高性能土壤固化剂及在地基处理中的应用[J]第九届土力学及岩土工程学术会议论文集2003 [5]朱祖梁,黄光明软土地基处理方法的实例分析[J]中国煤田地质,2005,6 [6]雷学文,白世伟,孟庆山,王吉利动力排水固结法加固饱和软粘土地基试验研究[J]施工技术2004 [7]郑刚,闫旺地基处理[J]第九届土力学及岩土工程学术会议论文集2003 11 一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇 至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 25mg/ml IPGT：溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。 1mol/LMgCl2:溶解20.3g MgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。 100mmol/L PMSF：溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹 或贮存于-20℃。 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－free RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套） 5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。 10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。 10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。 2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。 100％三氯乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制） 2.5％ X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。 100×Denhardt试剂（Denhardt's regent） 成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 2%聚蔗糖（Ficoll，400型） 2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40） 2%BSA（组分V） 水 2g 2g 2g 加水至总体积为100ml 依照上表称取各组分，溶于水中定容。过滤除菌及杂质，分装成小份于-20℃贮存。 10×标准DNA连接酶缓冲液（standard DNA ligase buffer）（粘端、平端连接） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 0.5mol/L Tris-HCl 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT 2mmol/L ATP 5mmol/L 盐酸亚精胺（可选） 0.5mg/ml BSA（组分V）（可选） 水 5ml 1mol/L 贮液 1ml 1mol/L 贮液 1ml 1mol/L 贮液 200ul 100 mmol/L 贮液 50ul 1 mmol/L 贮液 0.5ml 10 mg/mL 贮液 2.25ml 将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃。 mmol/L dNTP 溶液（dNTP solutions） 可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。 10mmol/L dNTP混合液 成分及终浓度 配制20ul溶液各成分的用量 10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP 水 2ul 100 mmol/L dATP 贮液 2ul 100 mmol/L dCTP 贮液 2ul 100 mmol/L dGTP 贮液 2ul 100 mmol/L dTTP 贮液 12ul 20％PEG 8000/2.5M NaCl 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分的用量 质量浓度为20％聚乙二醇 2.5mol/L 氯化钠 水 20g 50ml 5 mol/L 氯化钠 或 14.6g 固体氯化钠 补足100ml 加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中，加水至终体积100ml，用磁力搅拌器搅拌溶解。 20×SSC 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 300mmol/L 柠檬酸三钠（二水） 3mol/L 氯化钠 水 88.2g 175.3g 补足1L 溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10N NaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水 加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的体积分数为0.1％。在37℃温浴至少12h，然后在15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。 甲酰胺（deionized formamide） 直接购买或加Dowex XG8 混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中，用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，可去除甲酰胺中的离子。经Whatman 1号滤纸过滤除去树脂后分成小份，充氮气于-80℃贮存（防止氧化）。 磷酸缓冲液（phosphate buffer） 按照下表所给定的体积，混合1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L 磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。配制1 mol/L 的磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）贮液：溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:溶解142g于足量水中使终体积为1L。 1mol/L 磷酸二氢钠（ml） 1mol/L 磷酸氢二钠（ml） 最终pH值 877 850 815 775 735 685 625 565 510 450 390 330 280 123 150 185 225 265 315 375 435 490 550 610 670 720 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 TE（用于悬浮和贮存DNA） 成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 10mmol/L Tris－HCl 1mmol/L EDTA 水 1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃） 200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 98.8ml Tris缓冲液（Tris-HCl buffer） 将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。 浓盐酸的体积（ml） pH 8.6 14 21 28.5 38 46 56 66 71.3 76 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液 电泳缓冲液 50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 1mol/L 乙酸 mmol/L EDTA 水 242g 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L 5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 445 mmol/L 硼酸盐mmol/L EDTA 水 54g 27.5g 硼酸 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 补足1L 染料 1％溴酚蓝（bromophenol blue） 加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF） 溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。 10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide） 小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。 凝胶上样液（gel loading solutions） 6×碱性凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠mmol/L EDTA 18％聚蔗糖（400型） 0.15％溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF 水 300ul 10N 氢氧化钠 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.8g 15mg 25mg 补足到10ml 6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 15％聚蔗糖（400型） 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 1.5g 补足到10ml 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型） 水 2.5ml 1％溴酚蓝 2.5ml 1％二甲苯青FF 1.5g 补足到10ml 6×甘油凝胶上样液（4℃贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 50％甘油 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 3ml 3.9ml 6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 40％聚蔗糖 水 1.5ml 1％溴酚蓝 1.5ml 1％二甲苯青FF 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 4g 补足到10ml 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.2％溴酚蓝 0.2％二甲苯青FF 200 mmol/L EDTA 0.1％SDS 50％甘油 水 20mg 20mg 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)100ul 10％ SDS 5ml 补足到10ml 三.常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化钠 0.5g mol/L 氯化钾 2.5ml 用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。 SOC培养基 成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。 TB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 12g 酵母提取物 24g 甘油 4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。 2×YT培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 16g 酵母提取物 10g 氯化钠 4ml 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 YPD培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g 用水补足体积为1L后，高压灭菌。建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。 四.常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。第四篇：浅谈软弱地基处理方法研究进展
第五篇：分子生物学实验室常用试剂的配制方法
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