体外肿瘤药敏试验方法研究进展[精选5篇]

第一篇：体外肿瘤药敏试验方法研究进展

体外肿瘤药敏试验方法研究进展

甘萍

治疗肿瘤的方法主要有3种，包括肿瘤化疗、放疗、手术。其中肿瘤化疗在消灭微小肿瘤转移灶和手术切除后的残留肿瘤细胞治疗中有着手术与放疗无法达到的显著优势，但肿瘤化疗中仍有许多问题：①肿瘤病人个体间对化疗药物敏感性差异大；②肿瘤对化疗药物有耐药性；③化疗药物对许多类型的肿瘤特别是实体瘤的有效率不高；④化疗药物的选择性差，毒性大，杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞，给病人机体造成较大的损害。对于上述出现各种问题在临床上经验的化疗用药是无法保证肿瘤患者的个体有效性，因此个体化化疗在临床肿瘤化疗中就显得尤为重要。目前公认的较好的方法就是做肿瘤化疗药物敏感性试验(简称肿瘤药敏)，该方法的特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织进行首次培养，由于肿瘤细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生大的变化，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物,并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药，以提高化疗的靶向性，减少化疗药物的不良反应，降低细胞耐药性，成为肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。

目前，预测肿瘤药敏的方法已发展为体内和体外两大系列20多种药敏试验，并不断地朝着简单、快速、敏感、筛选作用方式不同的药物与临床有良好的相关性的方向迈进。而本文针对体外肿瘤药敏试验方法进行综述。人体肿瘤细胞集落测定(HTCA)它是利用肿瘤细胞悬液，置于双层琼脂中培养，通过选择性加入化疗药物培养后，计数细胞繁殖形成的集落数目，再评估肿瘤细胞对该药的敏感性。该法的优点：敏感、直接评价细胞增殖死亡。缺点：用于临床标本检测率低、周期长、集落计数繁琐。放射性标记代谢物前体掺入法(3H-Tdr assay)该法利用氚标记的胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作为核酸代谢物前体，测定一定时间内放射性标记的代谢物前体掺入的多少来判断药物对细胞增殖活性的抑制作用。该法的优点：操作简便、所需时间短、灵敏度高、重复性好，临床相关性与集落形成法相近，可适用于绝大多数恶性肿瘤。缺点：存在放射性污染，只能用于标记指数>5%的样品，显然无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用，而且胸腺嘧啶池的大小也可影响结果，故标记指数的变化不一定系抗癌药所致。此外，同位素的放射性也限制了它的应用。快速荧光分析法(FMCA)它是采用一些特殊的荧光染料(荧光素二乙酸酯)对细胞的特定成分进行染色或标记，或者通过细胞酶使无荧光性的材料分解或换成荧光材料，通过测定荧光强度而测出活细胞数量。活细胞中水解酶可将双醋酸根荧光素水解为荧光素发出荧光，测定荧光的强度可反映培养体系中活细胞的数目。该方法的优点在于：成功率为80%~95%。细胞用量小，半自动的终点测定法利于多种药物不同浓度的检测，尤其对于乳腺癌及易污染的胃肠道癌症的体外药敏成功率高；测定范围宽，细胞数在102～105之间时，荧光强度(F1)与活细胞数都能呈很好的线性关系；荧光分析法毒性低，能重复测定并可区分恶性肿瘤细胞和正常细胞，使临床抗肿瘤药物得以定量监测；荧光分析法重现性好，此法所依赖的水解酶一般比较稳定。缺点是：仪器要求高，且需专业人员操作；由于荧光猝灭现象存在，使测定过程变得复杂。MTT比色法

四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium，MTT)可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的甲臜(formazan)，甲臜的形成量与细胞的活力成正比，用比色法测定甲臜的量以判断药物对肿瘤细胞的杀伤程度。该法特点：①简便；②快捷，1周内可完成；③经济，临床应用广；④测定结果反映了所有的肿瘤细胞(增殖期及静止期)，适用于所有肿瘤类型；⑤与临床相关性好；⑥所需样本量适中(1×105～5×105个细胞/孔)；⑦为肿瘤药敏的常规方法。缺点：甲臜结晶的溶解度差。且检测到的是活细胞，不能区分正常细胞和肿瘤细胞，因此当应用于高度不均一的临床肿瘤组织时，难以准确反映药敏结果；所需细胞数较多，所测数据变异较大(抑制率分析变异系数在23 % ～30 %)，结果不稳定。三磷酸腺苷法(ATP)三磷酸腺苷(ATP)是活细胞代谢的主要能量来源，细胞死亡时，ATP在酶的作用下迅速水解，因此活细胞中ATP含量较死亡细胞含量高，通过测定癌细胞内ATP水平，了解抗癌药物敏感度。优点：重复性好，成功率可达90%~96%。ATP法能体现药物对整个肿瘤细胞群的杀伤作用，试验周期较短，所需细胞数量少、快速、简便，是一种很有前景的体外药敏试验。同时也适用于G0期细胞药敏分析。缺点：测定仪器昂贵(约15万元)、无法排除非癌细胞干扰等。染料排斥法(又名：区别染色细胞法differential staining cytotoxicity assay, DISC)该法利用快绿使短期培养(4 d)的死细胞着色，同时加入鸭红细胞作为内计数标准，以药物处理组与对照组残存肿瘤细胞的比值作为评价药物敏感性的指标，以残存肿瘤细胞小于50 %作为体外敏感的界限。该法最大优点：所需时间短(5 d)，易被临床所接受。另外，细胞用量少，有利于悬浮细胞存活率的测定。缺点：细胞计数繁琐，有些淡染细胞不易区分死活，染色时间要求准确，稍长则活细胞也染色，故敏感性较差。胶原凝胶液滴植入培养法(collagen dropletem bedded drug sensitivity test, CD-DST)本法是将癌细胞包埋于人工的细胞外基质即胶原凝胶滴中进行三维立体培养，使其在接近人体生理状态的环境中对抗癌药物的敏感性进行定量分析。该法优点：所需样本量小，癌细胞培养成功率高、药敏试验结果准确、可以除去混入的成纤维细胞的影响及可反映患者对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，对抗肿瘤药物的体外筛选和对个体化治疗具有实际应用价值。缺点：该法价格较贵，目前仅在日本广泛应用。流式细胞仪法

其原理：利用流式细胞术检测发生细胞凋亡的细胞数以及逃脱凋亡细胞中DNA损伤的程度。该法通过检测出细胞经药物作用后良好线性的剂量-效应关系，可以测得药物的协同作用，被认为能用于白血病和淋巴瘤的药敏试验中。优点：该法迅速简便，所需细胞数较少。缺点：仪器昂贵，技术要求较高，使其临床应用受到一定限制，临床应用报道不多。细胞凋亡法(TUNEL)

其原理为化疗药物对卵巢癌细胞的作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，通过计数细胞凋亡数目，判断肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。邱潮林等用细胞凋亡法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和MTT法在体外对白血病细胞株细胞、肝癌腹水中肿瘤细胞及实体瘤中分离出的肿瘤细胞对8种化疗药物的敏感性进行了检测。TUNEL和MTT法对白血病细胞株所测得的结果高度一致；对肝癌腹水中肿瘤细胞的药敏两法所得结果基本一致，而对实体瘤中分离出的肿瘤细胞同时用两法检测药敏的实验结果有较大差异，统计分析表明TUNEL优于MTT法。提示在细胞高度均一时(如白血病细胞株细胞)，TUNEL和MTT法均可准确反映药敏情况，而随着所分离的肿瘤细胞纯度降低，MTT法难以准确反映药敏实验结果。表明TUNEL法由于可直接在荧光显微镜下观察发生凋亡的肿瘤细胞，所以可减少混杂的组织细胞对结果的干扰。嗜银蛋白染色法

核仁组织区嗜银染色技术(silver-staining nucleolar organizer regions, AgNOR)，多用于肿瘤病理学的诊断和研究，但近年来，已有应用AgNOR研究肿瘤细胞对抗癌药物敏感性的预测。AgNOR是通过形态学方法来反映细胞增殖活跃情况，化疗药物的作用机制是通过多种途径作用于恶性肿瘤细胞，最终达到抑制癌细胞分裂增殖的目的，所以对抗癌药物敏感的肿瘤细胞AgNOR颗粒数应减少。AgNOR所得结果与MTT法所得结果得符合率为89%。张丽萍等应用人肺腺癌细胞(human lung adenocarcinoma cells, SPC-A1)等3株人体肿瘤细胞株，以MTT法及嗜银蛋白染色法，对长春新碱等6种化疗药物的敏感性进行了研究。结果发现两种方法有良好的符合率，且后一种方法经济、简便，可排除非肿瘤细胞的干扰，弥补了前一方法之不足。乳酸脱氢酶检测

抗癌药物与肿瘤细胞作用后，可使肿瘤细胞死亡溶解，细胞溶解以后，将释放一些释放物可使患者造成外周血中乳酸脱氢酶明显增高，所以乳酸脱氢酶可作为肿瘤化疗敏感指标。丘仑兴等用集落形成试验、MTT吸收光度法和乳酸脱氢酶测定3种方法检测5种常用抗肿瘤药物：多柔比星、氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和甲氨蝶呤对人宫颈癌HeLa细胞系的细胞毒作用。显示3种方法的检测结果有良好的相关性，均以多柔比星和丝裂霉素最有效。在这3种方法中，以集落形成试验最敏感；MTT法成功率高，适用于临床选择有效的化疗药物；而用药后乳酸脱氢酶值的升高则是化疗有效的可靠指标。端粒酶活性法

端粒酶是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标志物，几乎在各种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，而在正常细胞中基本无表达，Kim等创立了聚合酶链反应-端粒酶重复扩增法，能在大量正常细胞中探及1～10个恶性肿瘤细胞的端粒酶活性，并证实了恶性肿瘤细胞在一定数量范围内与端粒酶活性呈线性关系。据上述事实可以设想，可通过检测恶性肿瘤细胞体外经抗癌药物治疗后残留的端粒酶活性，作为判断肿瘤药敏的新的指标。

1999年，Faraon首先用聚合酶链反应-端粒重复扩增法测定50例恶性肿瘤标本对抗癌药的体外敏感试验，证实此方法有较高的敏感性和重复性，由于只能检测出恶性肿瘤细胞活性，故从理论角度来说较大地提高了测定结果的准确性。但需长时间聚丙烯凝胶电泳，放射自显影后进行扫描的方式分析显示扩增的6 bp梯度条带，故定量困难、检测时间长、需要同位素。目前改良的聚合酶链反应-端粒重复扩增-酶联免疫吸附(PCR-TRAP-ELISA)法测定肿瘤药敏可克服这些缺点，简称此方法为端粒酶活性法。翟晓波等提出端粒酶活性法敏感度远高于MTT法。优点：可以区分正常细胞和肿瘤细胞；灵敏度极高，可以检测出1～10个肿瘤细胞；可以应用于穿刺、活检标本,适应临床需要。缺点：成本高，技术要求高，结果不稳定(PCR扩增容易出现假阳性)，目前报道较少，缺乏大量临床验证。TECIA法

本法由江苏先声药物研究院首创，采用体外肿瘤组织块培养，通过分析给药前和给药后肿瘤组织面积的改变，获得多种单药或联合用药的肿瘤生长抑制率，从而为临床确定用药方案提供参考依据，TECIA法是在最接近在体状态的体外药敏试验。国内学者报道，与传统的单细胞培养MTT肿瘤药敏试验法相比，TECIA法具有简单易行、标本需量少、成功率和临床符合率高的优点。总蛋白染色法(sulforhodamine B potein stain assay，SRB法)SRB是一种蛋白质染料，可与经三氯乙酸固定后的细胞蛋白的碱性氨基酸作用而显粉红色，在515nm的吸收读数与细胞数呈良好的线性关系。1990年由Philup Skehan创立此法，随后即被美国癌症研究所列为常规抗肿瘤药物的筛选方法；1997年Papaazisis对此稍作改动，使其变异系数小，线性增强。有研究认为该法比MTT法更灵敏(每孔仅150个细胞)，培养时间更短。慧星试验(comet assay)Ostling利用DNA的碱基对可被强碱破坏，DNA的损坏表现为电泳条带的不连续性的原理于1984年建立该方法，被广泛应用于基因毒理学。本法快速、敏感，血液学肿瘤成功率为85%，固体肿瘤的成功率为60%，但不适用于破坏DNA的药物。二甲氧唑黄比色法(XTT colorimetric assay, XTT)

MTT法形成的甲臜产物不溶于水，为使其溶解所加的有机溶剂因具有挥发性，可对实验者及设备产生损害。Paull等在1988年合成出可产生水溶性甲的化合物XTT。XTT是一种与MTT类似的四氮唑衍生物，操作方法基本相同，不同的是加XTT的同时，需加电子耦合剂酚嗪硫酸甲酯，这样才能产生足够的水溶性甲物质，并且要现配现用。

吴楠等采用XTT体外细胞增殖和药敏检测，所得出的细胞生长曲线与MTT法结果相似，实验结果显示XTT产生的甲臜物质高于MTT，并且实验时间短，步骤简便，认为XTT法优于MTT法。细胞团法

经机械的和酶消化后的细胞团仍能保留其体内主要结构和某些功能，在一定的条件下具有与其体内相近的增殖特征。当化疗药物暴露于瘤细胞团块培养后48 h，通过检测细胞的形态学来反映药物敏感性。三维立体组织培养法(histoculture drug response assay, HDRA)

由Hoffman在1991年建立。该方法的基本原理是将肿瘤以组织块的形式在体外培养并加入化疗药物，观察组织块对不同化疗药物的敏感性。此方法的建立基于以下观点：单层的平面生长不利于细胞形态的展现，影响了细胞结构的完整性；结构完整性的丧失，又影响了瘤细胞的一些特异性表达；体外药敏试验缺乏体内的代谢环境；缺乏体内瘤细胞之间的相互联系。因此，将单层细胞培养改为组织块或多细胞球体培养，能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性等多种特性，模拟体内实体瘤内细胞的环境，会更加接近体内组织情况，与临床实际情况更为接近。

较早是采用3H-thymidine渗入法，现多采用MTT法观察组织块对化疗药物的敏感度。并引入计算机图像分析技术，形成组织块培养-终点染色-计算机图像分析法(tissue culture-end point staining-computer image analysis, TECIA)，进一步简化了实验步骤。优点：操作简便；成本低；可以模拟体内实体瘤环境；非常适用于临床应用。缺点：不同肿瘤细胞的选择性培养有困难。极端耐药试验(extreme drug resistance assay, EDR assay)

肿瘤药敏试验结果的阳性预测值往往远低于其预测耐药的准确性，通过体外药敏试验辨别不敏感的化疗药物，可以减少不必要的毒性反应、避免耐药性的产生。EDR assay是将肿瘤细胞植入软琼脂中培养，并长时间暴露于高浓度的化疗药物[血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为体内的5～80倍]。通过与阴性对照组比较，计算出个体的肿瘤细胞抑制百分率(percentage cell inhibition, PCI)。基于既往的耐药性检测结果，得出各化疗药物人群PCI的中位数(M)和标准差(SD)。按个体肿瘤细胞的PCI>M、PCI介于M与M-1SD之间和PCI

体外培养的活肿瘤细胞贴壁生长，受药物作用后凋亡或死细胞由于细胞挛缩、细胞膜完整性破坏而从培养基上脱落。基于上述原理，Precision Therapeutics公司于1996年开发出用于预测肿瘤化疗敏感度的Chem oFx assay。该试验通过将组织块在体外原代培养后获得足够数量的肿瘤细胞，经胰蛋白酶作用后，将特定数量的肿瘤细胞种入微孔板中培育，细胞贴壁生长。加入6种不同浓度的化疗药物作用一定的时间后，经冲洗、固定，移去死亡、不贴壁的细胞。贴壁留下的活细胞经核荧光染色后，通过自动显微镜图像分析系统计数，得出每种药物不同浓度的细胞存活率，并设阴性对照。数据汇总后，得出每种药物的剂量-反应曲线。Chem oFx assay的特点是(1)检验所需样本量小：实体肿瘤仅需35 mg组织，液体标本仅需40 mL，可用于穿刺活检及恶性胸腔积液和腹水等标本的检验。(2)检验药物的范围广，还可用于生物制剂的检验。(3)可对单药或最高三药联合的方案进行检验。(4)该检验中所使用的不同的药物浓度包括了体内肿瘤细胞暴露的药物浓度，检验结果对临床药物使用更具有指导意义。目前，Chem oFx assay可用于各种实体肿瘤的化疗敏感度检验,但尚未应用于血液肿瘤及淋巴瘤的检验。Mi等报道，Chem oFx assay对乳腺癌患者检测的成功率83.9%，可重复性高(变异系数<3%)；药敏试验中多西紫杉醇、卡培他滨的敏感性与临床疗效相关，预测乳腺癌新辅助化疗达到病理完全缓解的准确率为75%。一项对192例卵巢癌的研究提示，Chem oFx assay检测铂敏感性与总生存显著相关：铂敏感、中度敏感、不敏感的总生存期分别是72.5、48.6和28.2个月(P=0.03)。目前正在卵巢癌、乳腺癌患者中进行关于Chem oFx assay检验准确性的前瞻性临床试验。琥珀酸脱氢酶抑制法(Succinate Dehydrogenase Inhibition Test, SDI)该法细胞内三竣酸循环中有关合成ATP的重要酶类之一。1960年DalIner等人首次应用琥珀酸脱氢酶活性指标作为判断肿瘤细胞活性，当时酶活性测定使用氯化三苯四氮唑(TTC)作显色剂，寻敏度不高。1980年日本学者齐藤等人改用3(4,5-二甲-2-唾哇)-2,5-二苯一溴化四氮唑(MTT)，灵敏度提高了10倍。目前所用的即为改良SDI法。MTT无色，当接受唬拍酸脱下的氢后，即还原成紫红色的甲臜(formazan)，甲臜的生成量与活细胞数成正比，加入三氯醋酸溶剂停止反应，并溶出甲臜用分光光度计测定光密度，可用颜色深浅反映活细胞的多少。癌细胞受药物抑制则SD活性降低，紫红色较浅。

该法特点：试验简单、快速、灵敏、取材少、半自动、重复性好，是一种很有发展前途的体外恶性肿瘤药敏试验方法。且SDI试验不仅用于单个药物的敏感性测定，而且可用于不同稀释度化疗药物混合后同一条件下培养的联合使用及不同疗法的敏感性侧定。梯度离心法

梯度离心法是分离细胞常用的方法。其基本的原理：细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。梯度离心法本身不需要复杂的仪器设备，操作简单、可靠。Patient-Derived Xeugraft(PDX)法

鉴于目前广泛采用的实验动物细胞接种模拟肿瘤在体实验方法，美国西北医院Wenan Qiang ph.D 提出PDX肿瘤药效评价方法，并在课题组中的药物开发与肿瘤治疗研究中得到应用。出于现行细胞接种方法的弊端：细胞在体成瘤后（实验动物）的药敏结果并不等价于药物对患者有效，致使不少临床前有较好药效的药物惨遭临床淘汰原代培养的肿瘤细胞传代后大多数被淘汰，致使细胞的代表性减弱，PDX法采用患者肿瘤直接取样接种于实验动物体内，模拟人体实验环境（如，卵巢癌组织接种于实验动物卵巢膜下），培养观察，再通过实验动物实体瘤传代扩大培养用于药敏实验，实验结果更具代表性，对于患者能提供更直接的药效结果，便于临床治疗。但该法目前未广泛采用，技术难度较大成本相对较高。总结 综上所述，其中有些方法由于存在明显缺点，目前已很少使用。如放射性标记核酸前体掺入法需要使用放射性同位素，无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用(G0期细胞不进行DNA合成)；集落形成法需要细胞量大、试验周期长、工作量大、成功率低；荧光细胞印迹法技术难度大，难于推广；核形法需要有经验的病理学家判断结果，而且费时耗力、指标不够客观等。另外一些方法文献报道极少，难以判断其优劣。且由于肿瘤的恶性性质及目前肿瘤治疗的现状，医生和病人均希望有能够准确预测化疗药物敏感性的方法，能否与临床实际相符合是医生考虑的首要因素，价格、操作难易程度、需要的时间也在考虑范围之内。有少数文章对其中某些方法进行了比较，总体说来，后建立的方法优于早期方法(三维组织培养、ATP-TCA法优于MTT法，MTT法优于其他更早期的方法)，肿瘤药敏测定正在不断完善与提高。随着人民生活水平的提高，及对癌症治疗的要求越来越高，肿瘤药敏测定将有着良好的临床应用前景。

第二篇：地下水污染试验研究进展

地下水污染试验研究进展

叶为民，金麒，黄雨，唐益群

（同济大学岩土工程重点实验室）

由于人类活动的长期影响，在全世界范围内地下水环境均表现出不同的恶化趋势。为此，国内外许多学者对污染物在含水层中的运移、控制、修复进行了大量的研究工作。其中包括：

（1）污染物在地下水中运移的模拟及预测。利用室内或野外试验测定相关参数，结合数学模型，为地下水资源管理和已污染含水层的修复提供定量依据。

（2）防止污染源扩散的方案设计。通过计算分析，选择最佳治理方案。

（3）海水入侵问题。对人工开采地下水后海水与地下水过渡带的运移分析。

（4）高辐射性核废料处置库的选址问题。选择合适的处理库使核废料在其半衰期内与人类生存空间及环境隔离。

（5）饱气带中污染物的运移问题。评价农田施用化肥、农药、污水回灌对地下水水质的影响，以及了解土壤盐碱化过程，并确定排盐改碱过程。

（6）已污染含水层的修复研究。包括工程措施（客土、换土、隔离法、清洗法、热处理和电化法等）、施加改良剂（沉淀作用、抑制剂、吸附剂等）、农业措施（增施有机肥、控制土壤水分、选择合适形态的化肥等）、生物修复技术。

一、国外研究现状

国外对污染物在地下水中运移的研究和应用从20世纪初即已开始了。许多学者研究了多维弥散、重力分异、吸附效应等水动力弥散问题。由于石油在开采、储运和炼制的过程中常会发生外泄事故，渗漏的成品油会对地下水土壤造成严重的污染。目前这已经成为世界普遍关心的问题，于是国外学者把注意力转向了包括石油在内的非亲水相液体（简称NAPL），对NAPL在地下水中的运移、控制、修复等方面开展了大量的研究工作（如表1 所示）。

1、试验用污染物（NAPL）选择

NAPL 在地下水系统中的迁移是一个十分复杂的物理、化学及生物综合作用的过程，与一般和水混溶的无机污染物不同。由于NAPL 在地下水中存在明显的重力分异现象，根据其比重与水的差别分为轻非亲水相液体

（LNAPL）和重非亲水相液体（DNAPL）。轻非亲水相液体（LNAPL），如石油、煤油、对二甲苯（p-ylene）等，通过非饱和土层后，以自由态漂浮在地下水的表面；重非亲水相液体（DNAPL），如杂酚油、柏油、氯化烃等，由于溶解度较小，通过含水层滞留下来的污染物形成潜在的污染源，对含水层构成很大的威胁。

表1国外NAPL 在地下水中的迁移规律研究

在选择NAPL作为污染物时要考虑以下几点：（1）试验的可重复性和对比性。由于在市场上买来的石油等有机物组分含量不确定，因而通常采用单组分的溶剂，如对二甲苯、三氯乙烯；（2）NAPL的挥发性。NAPL的挥发性通常较大，应采取适当的措施(如土层上铺设土工布或降低室内温度等)减小污染物的挥发；（3）NAPL与水在不同比例下动力黏滞系数的变化。

2、孔隙介质及含水层

国外弥散试验不仅研究分层土，还包括含有夹层、阻挡物的土层。但多孔介质一般也还是采用渗透系数较大的砂土，这与黏土层中做弥散试验通常需要半年甚至更长的时间有关。

3、弥散试验装置

由于NAPL的野外试验耗资大且会对环境造成污染，对于它的研究通常是通过室内弥散试验进行的。国外使用的弥散槽大致可分为两种，平面二维弥散槽和垂直二维弥散槽，以模拟NAPL的水平二维弥散和垂直二维弥散。垂直二维弥散槽研究NAPL 在含水层中的重力分异问题。

4、研究内容

综合表1所列出的内容，可看出目前国外对NAPL进行的研究工作主要包括以下几个方面：（1）污染物组成对迁移和吸附的影响；（2）利用离心机研究污染物在含水层中的运移；（3）污染物含量及组成对含水层渗透性的影响；（4）非饱和土中污染物的迁移与吸力关系研究；（5）防止污染源扩散采取的措施研究；（6）受污染含水层的修复研究。

二、国内研究现状

我国20世纪80年代初才开始研究污染物在含水层中运移。1980年初山东地质局、长春地质学院、地质部水文地质研究所、山东大学等单位在济南市郊区进行了为预测地下水污染发展趋势的地下水质模拟试验研究工作。随后更多研究单位开展了大量的地下水质模拟试验研究工作，特别是对地下水环境污染数学模型研究中的弥散系数的研究，由于弥散系数具有尺度效应，国内的弥散试验重点大都集中在准确地确定弥散系数上。表2归纳了近年来国内部分室内野外弥散试验研究工作。

1、试验用污染物选择

理想的示踪剂应当是：无毒、廉价、能随水移动，即使以痕量存在也容易被测定出来且不改变地下水的天然流向，在所需要的时间内化学性质稳定；在所研究的含水层中不被所通过的固体吸附和滤出，同时又不在地下水中大量存在。国内室内弥散试验中所用到的污染物主要以可溶性物质为主，如NaCl、Cl-、萤光素钠盐等都很好得符合了上述要求，野外弥散试验大都是利用已污染的水源地作为弥散场地，其示踪剂因污染源的不同而可能采用有毒物质，如氚、氟、Cr6 +等。

2、孔隙介质及含水层

由表2可看出国内弥散试验大都是以砂子或更粗的卵石为孔隙介质，部分野外试验介质是黏土、砂土分层分布，但污染物主要从透水性较好的砂层中通过。以砂土为弥散介质避免了黏土层中取样的困难，同时减少了试验时间。但由于污染物在黏土中扩散的机理不同，吸附效应显著，把污染物在砂土中的研究成果直接应用于黏土中是不尽合理的。污染物在黏土中的弥散试验在国内尚未见报道。

同时，国内室内弥散试验所模拟的含水层大都是各向同性的饱和土层，这只是一种理想状态。实际上，天然状态的含水层大都是非饱和的，土层分层分布，有时还存在夹层或弱透水层。这时污染物的扩散机理显然与理想状态存在差异，有待进一步研究。

3、弥散试验装置

国内室内弥散试验大都是一维弥散，采用渗流柱作为弥散装置。孔隙介质通常是细砂或粗砂，渗流速度可达10-4m/s～10-3m/s，渗流柱长度一般采用100cm左右；经验表明，对渗流柱直径的选择，不能太小避免渗流柱侧壁对污染物运移的影响，也不能太大避免渗流柱中产生二维流，一般取10cm～20cm。

二维室内弥散试验一般采用矩形弥散槽，当模拟径向弥散时也可采用辐射状弥散槽。弥散槽的选择应遵循以下几条原则：（1）长宽足够大以模拟多维地下水流；（2）同时又不能太大，使试验在一定的时间内完成；（3）使用毒性相对小的化学试剂及砂土，以减小试验对环境和试验人员影响；（4）观测孔间距以可确定土层性质在空间上的变化为准；（5）布置有测压孔，测定各点水头值；（6）可收集土样做水质分析和土样分析，且不影响试验水流流向；（7）可精确控制边界条件和初始条件，包括两头水位；（8）可用现场测试技术收集数据，如饱和土中压力和饱和度的量测。

表2国内弥散试验研究

4、理论基础及局限性

国内的污染研究大多建立在水动力弥散方程解析解的基础上，利用已求得的解析解，计算水动力弥散系数及阻滞因子。虽然由于尺度效应的存在，不能把试验所得参数直接应用于现场。但是可以为数值分析污染物的运移提供参数，并将计算出的参数反代回解析解中验证数值解的可靠性。

但由于水动力弥散方程定解问题的复杂性，实际上只有在极为理想的条件下，才能求得弥散方程定解问题的精确解的表达式，并且由解析解也还不一定能求出弥散系数及阻滞因子，这限制了弥散试验的研究。已求得的几种典型弥散问题的解析解归纳如表3 所示。除此之外，还可利用叠加原理求解一些比较复杂情况的解析解。

表3已求得解析解的典型弥散问题

三、发展与展望

总而言之，前人对地下水污染问题已进行了大量的试验研究工作，并取得了丰富的成果。但对污染物在含水层中的吸附效应、非饱和土中的运移、黏土中的运移、弥散系数的尺度效应等方面的研究还有待进一步加强。因此，细颗粒孔隙介质(粉土、黏土等)中污染物的迁移问题；污染物在含水层中的三维弥散问题；各向异性(分层、夹层等)含水层介质中污染物的迁移问题；非亲水相物质(NAPL)在含水层中迁移过程中重力分异效应问题；吸附效应，包括分配系数和阻滞因子的研究问题；非饱和土层中的污染物多相迁移和吸力的关系问题；弥散系数的尺度效应问题等应成为未来地下水污染研究的热门课题。

冯翠娥摘自《水利学报》第36卷第2期，2005年

第三篇：甘油生产方法研究进展

甘油生产方法研究进展

甘油又称丙三醇，分子式C3H5(OH)3，是一种粘稠液体，有甜味，所以称为甘油；能与水以任意比混溶，有强烈的吸湿性，是重要的基本有机原料。1779年，瑞典化学家谢勒(Scheele)偶然从橄榄油与一氧化铅的反应中获得了甘油，这是人们第一次知道甘油的存在。

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最早，人们只将甘油作为皮肤的滋润剂，至1846年，沙勃里罗(Sobrero)将甘油与硝酸反应，得到硝化甘油。20年以后，诺贝尔将硝化甘油与硅藻土制成了安全炸药，使硝化甘油能顺利地应用于达纳炸药的生产。现在，甘油的用途已经十分广泛，主要用于医药、化妆品、醇酸树脂、烟草、食品、饮料、聚氨基甲酸酯、赛璐珞、炸药、纺织印染等方面。大约有1700多种用途。

由于石油等不可再生能源的日益消耗，寻找清洁的可再生能源成为化学工作者义不容辞的责任，甘油，来源于自然界，无毒无害，是理想的化工原料。因此，如何很好地开发甘油，发现它的新用途成为研究热点。本文对甘油的生产方法作一个综述，希望对致力开发甘油新用途的化学工作者有所帮助。

甘油主要以甘油酯的形式广泛存在于自然界中。所以，长期以来，大部分甘油是从油脂皂化生产肥皂以及从油脂水解产生脂肪酸的过程中作为副产物取得的。直到1858年，人们才知道用发酵法也能制甘油。第一次世界大战时期的德国，由于甘油缺乏，首创用甜菜发酵制甘油。从1948年起，用丙烯合成甘油的方法已开始在工业上应用，产量逐年上升，发展趋势较快。现在，甘油的工业生产方法按甘油的来源可以分为3类，即天然甘油的生产，发酵甘油的生产，合成甘油的生产。其中前2类方法的原料都是可再生的。1 天然甘油的生产

主要来自肥皂生产和油脂裂解过程的副产品；1948年以前，甘油全部从动植物油脂制皂的副产物中回收。直到目前，天然油脂仍为生产甘油的主要原料，其中约42%的天然甘油来自制皂副产，58%来自脂肪酸生产。

由于该方法以天然油脂为原料，且甘油是副产物，我国的化学工作者设想将其用于油脚的废水处理和利用上，既起到环保的作用，又得到一定的经济效应。如葛文光利用棉油脚生产脂肪酸后的废水回收甘油。安徽省应用技术研究所的冯立文等发表了动植物油脂及油脚生产油酸、甘油、硬脂酸、聚酰胺树脂的技术论文。国家脂肪酸技术研究推广中心的汪习生等介绍了《国家级科技成果重点推广计划》高效益环保项目”利用餐饮泔水油及废动植物油生产油酸、甘油、硬脂酸”新工艺。1.1 皂化甘油

皂化反应产物分成2层：上层主要是含脂肪酸钠盐(肥皂)及少量甘油：下层是废碱液，为含有盐类、氢氧化钠的甘油稀溶液，一般含甘油质量分数9%-16%，尤机盐质量分数8%-20%。

目前阔内提取甘油工艺主要采用传统蒸馏法，即将皂化废液经过澄清处理得到精废液，接着浓缩为质量分数40%的甘油，回收盐后浓缩为质量分数80%的甘油，再真空蒸馏、活性炭处理、压滤得到甘油产品。该法存在着产品质量低和能耗高等缺点，致使我国的低级甘油过剩，而98%以上的皂化或药用级甘油，尤其是99.9%的高纯度甘油，主要靠进口。

梁秉华等在采用传统工艺制得质量分数40%的甘油后，提出新的工艺流程。首先采用阳离子型高离子澄清剂进行中性条件下的第2步澄清处理，减少了副反应，除色和除臭效果好；第2步为色谱分离，使离子物和非离子物的盐、胶体和有色物从甘油中排除；最后进行树脂脱色、脱盐和真空浓缩，制得高纯度甘油。整个生产过程在100℃下进行，浓缩阶段也在110℃下进行，杂质少、能耗低，可制得低成本相当药用二级甘油。并且小试和中试对比了新、旧工艺在质量、技术经济指标和环保方面的特点和优势。分析了工业化规模的可行性 1.2 油化甘油

油化甘油指的是用油脂水解法生产的甘油。油脂水解的主产品是硬脂酸、油酸等油化产品，甘油是副产品。油脂水解得到的甘油水，其甘油含量比制皂废液高，质量分数约为14%-20%，无机盐的质量分数0%-0.2%。近年来已普遍采用连续高压水解法，反应不使用催化剂，所得甘油中一般不含无机酸，净化方方法比处理废碱液简单。我国油化甘油生产能力已突破万吨。

无论是制皂废液，还是油脂水解得到的甘油水所含的甘油量都不高(质量分数10%左右)，而且都含有各种杂质。所以，需要净化、浓缩的过程先得到粗甘油，然后将粗甘油进行蒸馏，脱色、脱臭的精制过程才能得到天然甘油。2 合成甘油的生产

从丙烯合成甘油的多种途径可归纳为2大类，即氯化和氧化。现在工业上仍在使用丙烯氯化法及丙烯过乙酸氧化法。2.1 丙烯氯化法 这是合成甘油中最重要的生产方法，共包括4个步骤，即丙烯高温氯化成氯丙烯、氯丙烯次氯酸化成二氯丙醇、二氯丙醇皂化得环氧氯丙烷以及环氧氯丙烷水解成甘油。2.2 丙烯过乙酸氧化法

丙烯与过乙酸作用合成环氧丙烷，环氧丙烷发生异构化为烯丙醇，然后在过乙酸氧化下生成环氧丙醇(即缩水甘油)，水解生成甘油。或者烯丙醇在双氧水氧化下直接生成甘油。

过乙酸的生产不需要催化剂，乙醛与氧气气相氧化，在常压、150-160℃、接触时间24s的条件下，乙醛转化率11%，过乙酸选择性83%。

上述后2步反应在特殊结构的反应精馏塔中连续进行。原料烯丙醇和含有过乙酸的乙酸乙酯溶液送人塔后，塔釜控制在60-70 ℃，13-20KPa。塔顶蒸出乙酸乙酯溶剂和水，塔釜得到甘油水溶液。此法选择性和收率均较高，采用过乙酸为氧化剂，可不用催化剂，反应速度较快，简化了流程。生产每吨甘油消耗烯丙醇1.001 t，过乙酸1.184t，副产乙酸0.974t。2.3 环氧氯丙烷法

用环氧氯丙烷合成的甘油，是一种工艺成熟、产品质量好的生产方法。1980年我国就引进了生产装置，目前我国合成甘油的年产能力在5kt以上，但长期以来受原料环氧氯丙烷货紧价高的影响，使合成甘油的生产能力尤法发挥。国外合成甘油产量很大，美国年产甘油300kt，其中合成甘油150kt。

在环氧氯丙烷生产中，产生大量副产品三氯丙烷，可综合利用，通过加热水解制各甘油。

(1)水解。在反应养内加入1 mol三氯丙烷副产品(混合物，沸程130-170 ℃)，加热回流，滴加醋酸钠水溶液(醋酸钠用量是三氯丙烷质量的3%)，滴完后即开始滴加1.5 mol的质量分数20%氢氧化钠溶液，滴加时间约为2h，回流温度由100℃左右逐步因共沸作用而降低到900℃左右，此后，因水解作用沸点逐步上升，直到110℃为止，(在滴完后约1 h)，抽样观察。反应物中油相消失，由二相变为一相，在110℃保持10min后，并在搅拌中逐步降温到70℃后继续搅拌1 h，开动真空泵，脱气10min，然后在常压条件下加热到85 c℃放料，用盐酸中和到pH为6为止，冷却。

(2)甘油水的纯化。经中和的产品是甘油水的饱和食盐溶液，加入少量多聚氯化铝净水剂，静置过夜，过滤去除不净杂质，去除表层浮油，如有结晶盐析出，必须用少量清水洗除盐表面所吸附的甘汕，再把洗液过滤后和第一次的滤液合并。所得产品为浅黄色的甘油食盐溶液。

(3)脱盐。把以上所制的产品在真空中(6.666-10.666kPa)脱水，沸点约50-60 ℃，当水馏出量约为总体积的1/6时，即把残液过滤脱盐，滤出的盐分必须先用未浓缩的甘油溶液来洗涤，再用淡水洗涤，洗液和浓缩液合并，重新真空蒸馏脱盐，如此反复5-6次，直到浓缩液中甘油的质量分数达80%以上，即可用为粗甘油处理。

(4)离子交换处理。把粗甘油用水稀释到质量分数20%左右，先用阴阳离子混合的离子交换柱处理，然后依次用阴离子树脂，阳离子树脂处理，如此反复3次，待甘油溶液中不含氯离子或钠离子，即可得去离子甘油水溶液。

(5)浓缩和蒸馏。把上述的甘油水溶液在13.332kPa，60℃左右浓缩到质量分数91.3%，用氢氧化钠把pH调节到8.5，然后在933.254h，170℃进行蒸馏，可得纯度在98%以上的纯甘油。

将天然油脂水解法和环氧氯丙烷法原料消耗作一粗略的对比，不难发现天然油脂水解法的优势，天然油脂水解法用的原料是肥皂废液，没有规格要求，价格便宜”习。就生产甘油总消耗的原料来看，天然油脂水解法也比环氧氯丙烷的要少。而且，合成法制甘油的设备投资大，成本又较高。然而，随着人们生活习惯的改变，肥皂的广阔市场逐渐被洗衣粉、洗涤剂等占领，肥皂的生产随之萎缩，肥皂废液回收甘油产量也相应减少。所以，许多化学工作者又将发酵法生产甘油作为努力的方向。3 发酵甘油的生产

利用淀粉类原料(谷物、玉米、红薯等)或糖蜜原料，经微生物发酵而产生。

我国研究发酵法始于20世纪50年代中期，从60年代兴起的耐高渗透酵母菌种的研究和应用到70年代处于鼎盛时期，到1994年至1995年，开始进入工业生产，特别是山东、江苏、甘肃等地的企业较多。

为了解决当时有的工厂因发酵周期长、产甘油率低而停产的情况，李亚东等，采用回用酵母发酵生产甘油，以期缩短发酵周期，提高产甘油率、减低残糖含量。2001年，唐军等作了采用Candida krusei的分批培养与补料分批培养生产甘油的探索。2003年，刘听等做了以蜜糖为原料利用耐高渗透压酵母生产甘油的研究。2005年，刘桂香等研究了利用邑蕉芋葡掏糖浆发酵生产甘油，降低发酵法生产甘油的成本。

1993-1994年，国内城乡企业以酒糟土生产复合甘油。酿酒的发酵醪液中，经分析含有质量分数约1.8%-3.5%的甘油成分，当蒸馏出乙醇后，所剩的酒糟巾即含行甘油。但所谓的从酒糟中生产甘油，并不是指这部分甘油，而是在酒糟中还含有未完全转化为乙醇的淀粉及其中间产物(质量分数约8%-10%)，利用这部分淀粉经糖化、催化发酵处理，生成甘油的方法。

以酒糟生产复合甘油工艺原料易得、成本低，但质量达不到要求，至1995年大部分企业停产。但是因该方法原料来源丰富，价格便宜，且绿色环保，我国化学工作者从未放弃对它的研究。许金木、熊联明等研究了利用酒糟来生产复合甘汕，以期代替甘油。然而，从酒糟中生产复合甘油巾于质量不高，用途很窄，不能完全代替精甘油。因此，化学工作者义对制精甘油的工艺进行了研究。其中，喻雪英等对废酒糟生产精甘油做了一些尝试。相信在不久的将来，此方法将会大大缓解我国甘汕紧张的局面。4 结束语

甘油是油化学产品的重要副产品，又是其它化学产品的重要原料，主要用途有医药、化妆品、香烟、炸药及食品。随着我国国民经济的不断发展，作为国计民生重要化工产品的甘油市场需求量不断增长，尤其是在涂料、化妆品工业和医药工业的需求在逐年增加。因此，开发国内甘油的生产和应用，对我国石油化学工业的发展意义重大。

第四篇：肿瘤分子靶向治疗药物研究进展1

肿瘤分子靶向治疗药物研究进展

杨 阳，刘宝瑞，钱晓萍

（南京大学附属鼓楼医院肿瘤科 南京 210008）

摘要：随着人类对癌症的细胞生物学和遗传学方面的认识达到分子生物学水平，新的治疗理念，治疗方法不断被提出。在传统的手术、放疗、化疗及生物治疗的基础上，恶性肿瘤的分子靶向治疗已成为肿瘤学最新的热门发展方向。新的分子靶向治疗药物以一些在肿瘤细胞细胞膜上或细胞内特异性表达或高表达的分子为作用靶点，能够更加特异性的作用于肿瘤细胞，阻断其生长、转移或诱导其凋亡，同时降低了对正常细胞的杀伤作用。一些分子靶向药物在相应的肿瘤治疗中已经展现出值得期待的疗效，本文将介绍近年来多种新型的肿瘤分子靶向治疗药物的原理及其临床研究进展。关键词：恶性肿瘤，分子靶向，抗肿瘤药物

Advances in the research on Specific Molecular Targeting

Anti-cancer Drugs

Yang Yang, Liu Bao-rui, Qian Xiao-ping(Department Of Oncology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University，Nanjing 210008, P.R.China)

Abstract: In the past decade, a great deal has been learnt about cancer, such as, oncogene, tumor suppressor gene, signal transduction, cell cycle and apoptosis.The treatment of cancer is evolving, propelled by advances in the molecular biology of tumor.The identification and characterization of molecular targets is rapidly changing the way that promising new anti-cancer compounds are developed and evaluated, such as monoclonal antibody against human epidermal growth factor receptor-2 Herceptin, monoclonal antibody against CD20 Mabthera, epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor Iressa and Tarceva, monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor Avastin, farnesyl transferase inhibitor Zarnestra, proteasome inhibitor Velcade, matrix metalloproteinase inhibitor prinomastat and marimastat, and so on.These new specific molecular targeting anti-cancer drugs are potent therapeutics for some tumors, for they can specifically target the molecule that overexpressing on tumor cells, thus reducing the side-effects of such drugs while increasing their effectiveness.In this review, we focus on the advances in the research on some specific molecular targeting anti-cancer drugs, introducing their elements, effect mechanism, curative effects and side-effects.Key Words: Tumor, Molecular Targeting, Anti-cancer Drugs

分子靶向治疗是指在肿瘤分子生物学的基础上，将与肿瘤相关的特异分子作为靶点，利用靶分子特异制剂或药物进行治疗的手段。近20年来，人类对癌症的细胞生物学和遗传学方面的认识有了飞速的发展。一系列重大发现包括癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、肿瘤血管形成等使癌症研究由细胞生物学水平转变到分子生物学水平，一系列新的概念包括信号传导、细胞周期、DNA修复等已经在从酵母、线虫到果蝇、小鼠等多种生物模型实验中得到验证。以此为基础，大量以肿瘤的分子遗传学改变及其在肿瘤细胞水平的表达为靶点的新的抗肿瘤药物已经走向临床，相对于传统的手术、放疗及化疗，具有更诱人的临床应用前景，其中包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、蛋白酶小体抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂等。

1.单克隆抗体

单克隆抗体是单一的B淋巴细胞克隆产生的针对一个抗原决定簇的单

一、特异、均质的抗体。早期使用的单抗为鼠单抗，具有很多缺点：用于人体后会产生“人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）”；人体免疫细胞Fc段结合鼠抗体Fc段能力较差；在人体内的半衰期很短。最近利用基因工程技术对鼠源性单抗进行人源化改造的研究取得了突破性进展，目前经美国FDA或各国相关机构批准上市的或正在申请的具有抗肿瘤作用的单抗药物已有十余种。

基于抗体的疗法其关键是选择合适的靶抗原，理想的单抗靶抗原应由肿瘤细胞而非正常细胞选择性表达或高表达。单抗药物对肿瘤尤其是血液系统恶性肿瘤的治疗已经产生了深远的影响，其主要优点是具有出色的靶向性，即这种治疗药物只在病灶处聚集起作用，而不在人体内广泛弥散分布，因而可达到降低药物剂量，减少毒副作用的目的。临床研究证明，单抗单独应用治疗肿瘤是有效的，并且在大多数情况下与常规化疗药物、放疗、免疫调节药物及其他单抗药物联合应用时具有协同作用。

目前临床用于治疗恶性肿瘤的单抗按其作用机制主要可分成两大类：（1）非结合性单抗，这一类单抗可以直接启动生长抑制信号或诱导凋亡，或者间接激活宿主防御机制发挥抗肿瘤作用；（2）偶联抗体，即单抗不具有诱导或激活作用，而仅作为其他活性药物的肿瘤组织靶向定位载体，这一类又可再分成3小类：①单抗-细胞毒药物偶联物，由单抗将药物运送至肿瘤组织，降低了细胞毒药物常规治疗时的全身毒性反应，如2000年上市的由重组人源化小鼠抗CD33单抗与细胞毒药物calicheamicin连接的gemtuzumab ozogamicin可用于急性髓细胞性白血病的治疗[1]；②单抗-放射性同位素偶联物，通过单抗定位将致死量的放射性物质运送到肿瘤组织杀伤靶细胞，如2002年初上市的由90Y标记的放射性鼠源性抗CD20单抗ibritumomab tiuxet可用于治疗rituximab以及其他药物治疗无效的非霍奇金淋巴瘤[2]；③单抗-药物代谢酶偶联物，通过单抗的靶向定位，使前体药物在局部代谢活化而发挥抗肿瘤作用，如用人源化抗癌胚抗原（CEA）F（ab`）2抗体与细菌酶——羧肽酶G2偶联可用以治疗多种实体瘤。

1.1.Herceptin 人类表皮生长因子受体-2（HER-2/neu，erbB-2）是一个185kD的跨膜受体，在许多上皮肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌等中过度表达，约25%~30%的原发性乳腺癌有HER-2/neu基因的过度表达。研究表明，HER-2不仅是一个生长因子受体而且是一个网络受体，p185HER-2糖蛋白增多，酪氨酸激酶活性增高使肿瘤具有侵袭性，并对化疗及内分泌治疗耐药，是独立的预后不良因素。Herceptin（transtuzumab）是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体嵌合抗p185HER-2抗体，可特异性结合p185HER-2。临床前研究显示Herceptin抗肿瘤机制为[3]：（1）下调细胞表面的HER-2/neu蛋白；（2）减少血管内皮生长因子的产生；（3）介导对过度表达HER-2/neu的肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）；（4）抑制HER-2/neu蛋白与受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）超家族的其他成员发生交联形成异质二聚体；（5）减弱细胞生长信号的传递；（6）通过诱导P27kipi和RB相关蛋白P130而大量减少S期细胞数目；（7）增强化疗所致细胞毒性。检测HER-2过度表达的方法很多，其中最常用的FISH和IHC法。

单一药物Herceptin对HER-2过度表达的晚期转移性乳腺癌是有效且安全的治疗方法，其作为一线药物的有效率为26%，其中HER-2（3+）患者有效率为35%[4]；作为二、三线药物总有效率为15%，其中HER-2（3+）患者有效率为18%，且Herceptin能显著改善QOL[5]。Herceptin联合应用化疗药物治疗HER-2过度表达的乳腺癌也可明显提高疗效，联合应用的化疗药物包括阿霉素或紫杉醇[6]，及长春瑞滨[7]。Herceptin的常见副作用与其他单克隆抗体相似，主要为输液相关症状，包括寒战、发热、疼痛、呕吐、乏力等，多在首次用药后发生，给予扑热息痛、苯海拉明或派替啶即可缓解。联合化疗后化疗的轻中度不良反应有所加重，常见心功能不全，多见于与蒽环类药物联合应用时。

1.2.Mabthera Mabthera（Rituxan，Rituximab）是人源化抗CD20单抗，CD20表达于前B细胞到活化了的B细胞阶段，但干细胞和浆细胞阶段并无表达，与细胞生长和分化有关，90%以上的B淋巴细胞瘤（NHL）中均有CD20的表达。Rituximab的作用机制为：（1）抗体依赖的细胞毒性作用（ADCC）；（2）诱导补体介导的溶细胞作用（CDC）；（3）抗体介导的肿瘤细胞凋亡；（4）使化疗耐受性淋巴瘤细胞重新敏感化。

Mabthera主要用于复发或难治性低度恶性和滤泡型B细胞淋巴瘤，单药有效率为48% [8]；间隔6个月重复给药有效率可上升至73% [9]；对其他淋巴瘤包括套细胞淋巴瘤（mantle-cell lymphoma，MCL）、免疫细胞瘤（immunocytoma，IMC）及小B细胞淋巴瘤（small B-cell lymphocytic lymphoma，SLL）的有效率分别38%、28%及14% [10]。Rituximab单药治疗低度恶性或滤泡型淋巴瘤有效且耐受性好，但易复发，可重复应用或联合应用化疗或干扰素-α、G-CSF等[11]。Rituximab的副作用主要是输液反应相关，常发生在首次输注开始后30min至2h，暂停或减慢输注可缓解。

1.3.Panorex Panorex（edrecolomab）为1995年德国政府主管部门批准用于治疗结肠癌的鼠源性IgG2a单克隆抗体，靶目标是癌细胞表面抗原17-1A。其抗肿瘤作用机理[12]为：（1）抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）；（2）补体依赖性溶细胞作用（CDC）；（3）诱导凋亡作用；（4）诱导对第一抗体（ab1）的免疫反应，即诱导了特异型网络反应（idiotypic network response）。

临床试验已经证实Panorex对结肠癌、乳腺癌及其微小转移灶具有良好的作用。Panorex治疗Duke’s C期结直肠癌较非Panorex治疗组总病死率减少32%；总生存期及无病生存期均明显延长；复发率及远处转移明显减少[13]。

2.表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂

表皮生长因子（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，由细胞外特异性配体结合部分、穿细胞膜部分、具酪氨酸激酶活性的细胞内部分组成。EGFR在所有表皮来源性正常组织的细胞中均有表达，大约1/3的人体肿瘤过度表达EGFR，尤其是头颈部鳞状细胞癌（80%~100%）、结肠癌（25%~77%）、胰腺癌（30%~95%）、非小细胞肺癌（40%~80%）、肾癌（50%~90%）和乳腺癌（14%~91%）等。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）等多种配体可与EGFR胞外部分结合，将有丝分裂信号向胞内传递，从而调控细胞周期，调节细胞生长与分化，促进损伤修复，EGFR还可活化其下游的血管表皮生长因子受体（vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR），促进实体瘤微血管网形成，因此EGFR在肿瘤细胞的发生发展、分化、修复及转移中发挥重要的作用。以EGFR作为治疗靶点的研究很多，其中以单克隆抗体及酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）最为成功，前者如C225等，后者为小分子化学制剂，作用于EGFR细胞内部分，可封闭EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点从而达到特异性抑制EGFR的目的。

2.1.Iressa Iressa（gefitinib，ZD1839）是一种可口服的EGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂，可抑制非小细胞肺癌（NSCLC）和其他肿瘤如结直肠癌、头颈部癌、前列腺癌、乳腺癌细胞的生长及存活，其可能的机制包括：（1）竞争EGFR-TK催化区域上Mg-ATP结合位点，阻断其信号传递；（2）抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡；（3）抑制肿瘤血管生成。

在各类肿瘤病人中进行的I/II期临床试验结果均显示了Iressa的临床功效及良好的耐受性，尤其是对NSCLC的治疗。单药Iressa治疗铂类为主化疗治疗失败的NSCLC患者有效率为19.0%[16]。I/II期临床的良好表现使一项其与化疗药物联用的III期临床试验（INTACT）迅速进行，但结果令人失望。在超过1000名患者的INTACT2中，铂类为主单独化疗组、化疗联合250mg及500mg Iressa组的有效率分别为32.5%、31.5%及32.0%，生存期分别为9.9月、9.8月及8.7月，均无明显差异，副作用亦无增加[17]，有研究分析这是由于Iressa的作用被化疗药物的作用掩盖所致。Iressa副作用均较轻微且停药后即终止，最常见为皮疹[18]。

2.2.Tarceva Tarceva（erlotinib，OSI-774）是另一种可口服的EGFR-TKI，在单药或联合化疗及其他抗肿瘤药物治疗NSCLC及其他一些实体瘤上已经显示出令人鼓舞的作用[19]，其中单药口服治疗复发的进展期NSCLC患者中位生存时间为8.4个月，有趣的是，主要副作用皮疹的发生率和生存期相关。联合吉西他滨治疗进展期胰腺癌、联合细胞毒药物作为一线方案治疗IIIB/IV期NSCLC的TALENT和TRIBUTE试验、作为单药治疗复发的进展期NSCLC的BR.21试验均有望在2003年年底到2004年年初得出结论。与Iressa类似，Tarceva的毒副作用主要是皮疹及腹泻，均轻微且可逆。

2.3.IMC-C225 Cetuximab（IMC-C225）是一种抗EGFR的单克隆抗体，其抗肿瘤的机制为：（1）调节细胞周期，导致细胞停留在G1期；（2）通过下调血管内皮生成因子（VEGF）等相关因子抑制血管生成及转移；（3）通过打破凋亡促进因子Bax与凋亡抑制因子（bcl-2）基因的平衡表达从而促进细胞凋亡；（4）增强化疗作用；（5）增强放疗作用。

Cetuximab对EGFR阳性的肿瘤，如头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、非小细胞性肺癌及非雄激素依赖性前列腺癌，无论单药治疗还是与放化疗结合都可以提高生存率，延长缓解期。对失去手术机会且对放化疗不敏感的头颈部鳞状细胞癌和结肠癌患者分别采用C225+顺铂及C225+CPT-11的方案治疗，总有效率分别达到了26%及20%[14]。此外C225联合阿霉素、紫杉醇、吉西他滨等的研究也在进行中。研究显示C225还可提高鳞状细胞癌对射线的敏感性，这是通过增加G1期细胞而降低S期细胞来提高射线的杀伤能力的。对进展期头颈部鳞状细胞癌C225联合放疗有效率为100%[15]。C225无论单用还是与放化疗联合应用都耐受良好，副作用轻微且易于控制，常见的有麻木、发热、恶心、皮疹，过敏反应也较常见，多发生在首次用药时，使用抗组胺药或缓慢注射均可缓解。

3.bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂

慢性骨髓样白血病（CML）大约占所有类型白血病的20%，骨髓移植及α-干扰素是常规的治疗方案。90%以上的CML、5%的儿童ALL、20%的成人ALL及2%的AML患者的白血病细胞中均可检测到费城染色体（Ph+），即9号染色体长臂上的原癌基因c-abl易位至22号染色体长臂的断裂点集中区bcr时t（9：22）（q34：q11），形成bcr-abl融合基因，编码p210、p190、p230三种蛋白，增强酪氨酸激酶活性而导致粒细胞的转化和增殖，在白血病尤其是CML的发病中起着关键作用。

Glivec（Gleevec，imatinib mesylate，STI-571）是基于上述研究结果并通过计算机辅助设计由人工合成的bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂，可选择性抑制bcr-abl、c-kit和血小板源性生长因子受体（PDGFR）的酪氨酸激酶或底物蛋白的酪氨酸磷酸化而使其灭活；其中c-kit激酶是干细胞因子（SCF）受体，在70%的小细胞肺癌和胃肠道基质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）患者体内表达。此外，Glivec还可选择性抑制bcr-abl阳性细胞生长并诱导bcr-abl阳性细胞凋亡和分化；与干扰素联合用药具协同效应，与柔红霉素、阿糖胞苷、长春新碱、高三尖杉脂碱、依托泊甙及多柔比星联用出现累加作用，但与米托蒽醌联用时则产生拮抗效应。

Glivec可用于CML加速期、急变期和慢性期干扰素耐药的患者，及不能手术的GIST，其中对干扰素治疗失败后的CML慢性期、加速期和急变期患者的血液学有效率（CHR）分别为88%，63%及62%[20]，对进展期GIST总有效率53.7%[21]。Glivec治疗CML具有较好疗效，但易复发并产生耐药性，其可能的机制为：（1）bcr-abl过度表达超出了药物能够抑制的有效范围；（2）bcr-abl发生了点突变，结果阻碍了Glivec与bcr-abl的结合；（3）体内α1酸糖蛋白能够结合并抑制Glivec。

多数患者可出现不良反应，表现为恶心、呕吐、水肿、肌肉痉挛、腹泻和头痛，但均为轻至中度，高剂量或年龄大于65岁患者常发生不同程度体液潴留，加速期及急变期患者可出现血小板减少症或中性粒细胞减少症。

4.血管内皮生长因子抑制剂

人体大部分肿瘤的生长和转移都依赖于病理条件下的血管生成，因此，抑制肿瘤介导的血管生成为肿瘤治疗提供了一个非细胞毒性的新途径，抗血管生成疗法能够提高抗肿瘤治疗的效果，且并不增加其副作用。血管生成是一个受多众多正性或负性调节因子调节的复杂生理过程，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生成因子。目前靶向VEGF及其受体的抑制剂很多，研究较多的是VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂及VEGF单克隆抗体，前者属于小分子抑制剂，具有口服易吸收、剂量小，可长期用药等优点，包括SU5416、SU6668、ZD4190、ZD6474、PTK787等均已进入临床试验。后者如Avastin等。

Avastin（bevacizumab，rhuMAb-VEGF）是第一个人源化的抗VEGF单抗，能够结合并阻断VEGF的作用，从而发挥抗肿瘤活性，无论单用或联用细胞毒药物副作用均可耐受。Avastin联合应用FL方案化疗对未经治疗的转移性结直肠癌患者有效率为40%[22]；联合应用IFL方案治疗转移性结直肠癌有效率为45%[23]。

5.法尼基转移酶抑制剂

大约30%的人类肿瘤与RAS基因突变有关，包括90%的胰腺癌，50%的结肠癌，40%的肺癌及膀胱癌。RAS蛋白定位于细胞膜内侧，接受来自细胞外生长因子、细胞因子及激素等信号，在细胞内信号传导中发挥重要作用，其作用类似于开关，切换于非活性的GDP结合型与活性的GTP结合型，活化的RAS-GTP蛋白可促进细胞增殖。RAS蛋白需要经过一系列的加工修饰才能定位于细胞膜内侧，其中法尼基化是第一步也是其中最重要的一步，法尼基转移酶抑制剂（farnesyl transferase inhibitors，FTI）干扰RAS蛋白的法尼基化修饰，可使RAS基因激活的肿瘤生长受到抑制，且对正常细胞无明显毒性。目前已进入临床试验的FTI有R115777（Zarnestra）、SCH-66336（Sarasar）、BMS-214662、L-778,123等。

Zarnestra（R115777）是一种可口服的FTI，能够特异性阻断生长因子依赖性的细胞信号传导途径蛋白的法尼基化。已进行的临床试验的适应症包括急性白血病、结肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌等[24]。大剂量时可见中枢神经毒性包括共济失调及失语，其他不良反应还包括恶心、疲劳、骨髓抑制及感觉异常。

6.蛋白酶小体抑制剂

蛋白酶小体是一个大型的蛋白复合体，存在于所有真核细胞的细胞质及细胞核中，在细胞内蛋白降解途径中起主要作用，其中最重要的作用是通过降解细胞内的调节蛋白或其抑制蛋白而调控细胞内调节信号如细胞周期及细胞凋亡。蛋白酶小体抑制剂（proteasome inhibitor）能够阻断蛋白酶小体的降解作用，使细胞内多种调节蛋白持续稳定表达，破坏细胞周期，最终促使细胞凋亡。研究表明，蛋白酶小体对肿瘤细胞的作用较正常细胞大很多，除了增生活跃细胞对蛋白酶小体引起的凋亡更敏感的因素外，正常细胞的细胞周期检查点机制也对细胞稳定起了关键作用[25]。此外喜树碱结合的拓扑异构酶I也是蛋白酶小体的底物，抑制了蛋白酶小体可使该复合物稳定，而加强其效果。

蛋白酶小体抑制剂Velcade（bortezomib，PS-341）已被批准用于治疗复发的或顽固的多发性骨髓瘤，有效率为35%，患者接受输血次数可明显减少，肾功能不全患者病情得到稳定和改善，毒副作用包括血小板减少症、疲劳、周围神经毒性及嗜中性粒细胞减少症[26]。针对转移性结直肠癌和晚期非小细胞肺癌的II期临床试验已在进行中。

7.环氧化酶-2抑制剂

有研究表明，长期使用非甾体抗炎药（NSAIDs）的病人患结肠癌的几率较低。NSAIDs主要通过抑制环氧化酶（cyclooxygenase，COX）发挥抗炎作用，COX是炎症过程中一个重要的诱导酶，能诱导前列腺素生成。COX包括两种同功酶，COX-1定位于内质网，在大多数正常细胞中都呈稳定的表达；COX-2定位核膜及内质网，仅在细胞受到刺激时迅速从头合成，参与炎症过程及肿瘤的发生发展，除结肠癌外，COX-2在多种肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等均有过度表达，其对肿瘤发生发展作用机制可能包括：（1）通过合成前列腺素影响细胞的生长增殖与分化；（2）抑制细胞凋亡；（3）使肿瘤细胞侵袭能力增强；（4）促进肿瘤血管生成；（5）诱导炎症反应抑制机体的免疫反应。相比于传统的NSAIDs，特异性的COX-2抑制剂仅对COX-2有作用，而对行使正常生理功能的COX-1没有抑制作用从而增加了特异性并减少了毒副作用。

目前研究较多的COX-2抑制剂包括celecoxib、rofecoxib、NS-398、SC-58125等。Celecoxib（SC-58635）是第一个用于临床的特异性COX-2抑制剂，1999年FDA批准用于关节炎及骨关节病的治疗，次年又批准用于用于治疗家族性腺瘤样息肉[27]。目前celecoxib用于治疗结肠癌的III期临床试验已在进行中。

8.基质金属蛋白酶抑制剂

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）是细胞外降解基质的一大类酶系，包括至少16种含有锌和钙的蛋白分解酶，在细胞外基质（ECM）的生理过程中维持适当的组织功能和体内平衡。在癌症的病理过程中，特异性MMP被用来促使细胞外基质解构，从而促使肿瘤的生长、组织浸润、转移和血管生成。各种肿瘤中广泛存在MMP-2和MMP-9的过度表达，包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、头颈部癌、前列腺癌和肺癌等。

Batimastat是第一代MMP抑制剂，主要缺点是口服生物利用度低；marimastat（BB-2516）属于广谱型可口服第二代MMP抑制剂，对晚期胰腺癌，可延长患者生存期，疗效与健择相当[28]，常见副作用为骨骼肌肉疼痛，呈剂量依赖性，停药后消失；prinomastat（AG3340）是一种对MMP-2、3、9、14有选择性作用的MMP抑制剂，从而降低了副作用，目前正在进行与紫杉醇/卡铂合用治疗非小细胞肺癌，与米托蒽醌/泼尼松合用治疗晚期激素不敏感性前列腺癌的临床试验；其他进入临床试验的MMP抑制剂包括metastat（COL-3）、neovastat（AE941）、BMS-275291等。

9.小结

由于对恶性肿瘤的细胞生物学及遗传学的更深入了解，越来越多的抗肿瘤作用靶点被发现并研制了相关靶向药物，除了上文提及的药物外，还有一些药物也在研究中，包括端粒酶抑制剂、针对DNA修复机制的药物、多靶点叶酸拮抗剂、蛋白激酶C抑制剂、细胞周期依赖性激酶抑制剂、MARK激酶抑制剂等。

对这些药物作用机制的进一步研究在一定程度上改变了人们对肿瘤的认识，以往被看作相同的癌症类型事实上可能是互相不同的分子疾病，因而在原有分类基础上，我们还可以进一步依照其分子水平的特性再分成各亚型，分别给予不同的处理方案。新型的靶向抗肿瘤药物已经显示出了良好的抗肿瘤作用，但毕竟使用时间尚短，目前大多数仍只作为二线或三线用药，相关的临床试验仍在进行完善中。此外，由于作用机制不同，靶向药物与细胞毒药物联合应用可能发挥更好的效果，相关的研究也将是今后研究的重点。

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第五篇：与耐药机制有关药敏试验的规范化.精讲

与耐药机制有关药敏试验的规范化

与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。

前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。

在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。

我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。

包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。

首先介绍青霉素酶的检测。检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的 β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生 β-内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。

方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行 β-内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。

葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的检测。这项内容呢是 CLSIM100 — S21。方法，如果青霉素对葡萄球菌的MIC值小于等于0.12每毫升微克的时候 或者抑菌环直径大于等于 29毫米 的时候，应该对其进行可诱导 β-内酰胺酶的检测。将待检菌株传代到血琼脂平板或者是MHA琼脂平板上，用苯唑西林纸片或者是头孢西丁纸片作为诱导剂，具体方法可参照纸片扩散法药敏试验，大气环境孵育16到18小时后，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。可诱导 β-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。质控菌株，阴性株用金黄色葡萄球菌 ATCC25923；阳性株用金黄色葡萄球菌 ATCC29213。

CXIM100 — S22 文件中增加了用10单位青霉素纸片作为诱导剂检测葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的方法，具体方法同苯唑西林和头孢西丁纸片法。

第二个内容介绍甲氧西林耐药葡萄球菌，也就是MRS检测。检测mecA基因和其表达的青霉素结合蛋白 2a，是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法，它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA 基因或者是产PBP 2a 的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林耐药。不携带mecA或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见的非mecA基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC值大于等于4个每毫升微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报告苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。

苯唑西林纸片扩散法筛选试验，方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片，而不是甲氧西林或萘夫西林来检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备接种物，配成0.5麦氏比浊浓度菌液，接种MH琼脂平板，待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33至35度，大气环境孵育24小时，检测抑菌圈直径。结果判断，按CLSI解释标准判断结果。金黄色葡萄球菌抑菌圈直径小于等于10个毫米为耐药，大于 13毫米 为敏感。质控菌株用金黄色葡萄球菌ATCC25923。

注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；孵育时间不能少于24小时；在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有没有细小菌落或者轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药；如果金黄色葡萄球菌纸片扩散法结果中，结果为中介时也就是直径在11到 12毫米 时，或者 MIC 为0.5到2个每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起严重感染时，必须进行mecA基因或者是PBP 2a 测定，或者是头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC试验或者是苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS菌株，选择其中一种试验结果进行报告。

苯唑西林盐琼脂筛选试验，试验用的MH琼脂中含苯唑西林每毫升6个微克，并添加有4%的氯化钠，或者是每毫升0.68摩尔。方法，直接菌落悬浮液获得0.5麦氏单位浓度。进行试验时，使用1微升接种环蘸取菌液，在平板上涂成直径10到 15毫米 斑点。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区域。将琼脂平板置33到35度，大气环境孵育24小时后用透射光检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐药。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需将琼脂平板孵育48小时。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株ATCC43300。

头孢西丁纸片法。方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克头孢西丁纸片，33到35度大气环境孵育。金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌孵育16到18小时报告结果，凝固酶阴性葡萄球菌除路邓葡萄球菌以外要孵育24小时，如耐药则在孵育18小时后可报告结果。使用反射光阅读头孢西丁纸片试验结果。结果判读，头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 21毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 22毫米 应报告对苯唑西林敏感。除路邓葡萄球菌外其他凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 24毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 25毫米 应报告对苯唑西林敏感。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，头孢西丁纸片试验是首选方法，因为头孢西丁较苯唑西林的敏感性高。

mecA基因及PBP 2a 检测，方法，可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进行检测。结果判断，mecA基因或PBP 2a 检测阳性的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林和甲氧西林耐药。不携带mecA基因或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林和甲氧西林敏感。质控菌株，mecA阴性用ATCC29213；mecA阳性用ATCC43300。苯唑西林MIC试验方法，可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判读，若苯唑西林MIC值大于等于每毫升4个微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报苯唑西林耐药。可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。注意事项，一，试验温度超过35度不能检测出MRS；二，孵育时间不能少于24小时；三，在透射光下观察琼脂上有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株 A TCC43300。

MRS的临床报告，对于甲氧西林耐药的葡萄球菌即 M RS，应报告对所有 β-内酰胺类药物耐药，而不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感。因为大多数文献报告了MRS感染对 β-内酰胺类治疗反应差或者没有令人信服的临床数据证实这些药的临床效果。

万古霉素耐药葡萄球菌的筛选试验，一，纸片筛选法；方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克万古霉素纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。结果判断，CLSI M100-S19中已经取消了万古霉素对葡萄球菌的纸片扩散法判断折点。纸片扩散法只能检测VanA基因型的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，这种菌株无抑菌圈，应确认该菌株的鉴定结果。对未测定万古霉素MIC，而万古霉素抑菌圈直径大于等于 7毫米 的葡萄球菌，不能报告其对万古霉素敏感。

注意事项，纸片扩散法检测万古霉素结果不可靠。纸片扩散法不能区分万古霉素敏感，也就是MIC范围在0.5至2个微克每毫升和万古霉素敏感性减低的菌株，也就是MIC值在4到8每毫升微克。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌MIC大于16每毫升微克，在万古霉素纸片周围仅见轻微生长。因此，用含每毫升6个微克万古霉素的BHI 琼脂平板筛选平板，可提高检测万古霉素中介和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。

琼脂筛选法，用含每毫升6个微克万古霉素脑心浸液琼脂对耐万古霉素金黄色葡萄球菌进行筛选试验。方法，直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度，使用微量吸管吸取菌液10个微升，点种琼脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，挤去多余的菌液，在平板上涂成直径10 到 15毫米 斑点或在部分区域划线接种，35加减2度，大气环境孵育24小时，观察结果。结果判断，在透射光下仔细观察，如果点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。注意事项，用含每毫升6个微克万古霉素BHI琼脂筛选平板，可提高检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。但琼脂筛选法不能可靠检测VISA，这是葡萄球菌对万古霉素中介的菌株，MIC值等于4个每毫升微克菌株不生长。质控，敏感株 ATCC29212；耐药株 ATCC51299。

万古霉素MIC确认试验。方法，可采用琼脂或肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判断，金黄色葡萄球菌MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值在4到8每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于16每毫升微克为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌MIC值小于等于每毫升4个微克为敏感，MIC值在4到16每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于等于32每毫升微克为耐药。注意事项，检测到万古霉素MIC值大于等于每毫升8个微克的金黄色葡萄球菌，或者是MIC值大于等于每毫升32微克的凝固酶阴性葡萄球菌，应送参考实验室进一步确认。

诱导性克林霉素耐药试验检测，耐药机制，对大环内酯耐药的葡萄球菌或者是 β-溶血链球菌，可能存在有结构性或者是诱导性对克林霉素的耐药，或者只对大环内酯类耐药。检测方法，诱导克林霉素耐药试验又称“D”抑菌环试验。配养基，用 MH 琼脂，加或不加5%的绵羊血。接种物，直接菌悬液法，相当于0.5麦氏标准浓度。孵育，35度加减2度，大气环境16到18小时。方法，贴红霉素纸片和克林霉素纸片，纸片间距离15至26毫米。结果判断，若靠近红霉素纸片一侧克林霉素的抑菌环出现“截平”现象，也就是称为“D”抑菌环，则菌株存在克林霉素诱导耐药，应报告对“克林霉素耐药”。在报告单中可注明“经诱导克林霉素耐药试验推测此菌株对克林霉素耐药，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。

质控菌株，阴性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC 25923或者是金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-976。阳性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977。

金黄色葡萄球菌，高水平莫匹罗星耐药性检测。纸片扩散法，方法，用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含200微克莫匹罗星纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。在透射光下仔细观察纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示莫匹罗星耐药。结果判读，无抑菌圈等于高水平莫匹罗星耐药； 有抑菌圈等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株，ATCC25923莫匹罗星抑菌圈直径在29至38毫米；ATCC BAA1708无抑菌圈。

肉汤微量稀释法，用调节阳离子M-H肉汤配成单一的莫匹罗星，也就是每毫升256微克试验孔。方法，应用标准的肉汤微量稀释法试验条件进行接种，在35加减2度，大气环境孵育24小时。结果判读，在透射光下进行判读。如果有生长等于高水平莫匹罗星耐药；无生长等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株ATCC 29213，MIC 值应该在0.06至0.5每毫升微克；ATCC 29212 MIC 值应该在16到128每毫升微克；ATCC BAA1708应该在256每毫升微克生长。解释，尽管CLSI M100-S22中未提供莫匹罗星的折点，但纸片扩散法和MIC筛选试验能识别出莫匹罗星MIC值大于512每毫升微克的菌株即高水平耐药株。

肠球菌对青霉素或者氨苄西林耐药性检测。肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白，个别菌株是产生 β-内酰胺酶。纸片扩散法药敏试验可准确测定PBP改变的菌株，但对产 β-内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应检测 β-内酰胺酶。

高水平氨基糖苷类耐药肠球菌的检测。方法，用高浓度庆大霉素也就是每片120微克，或者是链霉素每片300微克纸片可以筛选出此类耐药性。结果判断，无抑菌圈为耐药，抑菌圈直径大于等于 10毫米 时表示为非高水平耐药。抑菌圈直径在7到 9毫米 的菌株应使用稀释筛选试验进行检测。对于庆大霉素，稀释法的MIC值大于每毫升500微克即为耐药。对于链霉素，微量肉汤稀释法的MIC值大于每毫升1000微克，琼脂稀释法的MIC值大于每毫升2000微克，即为耐药。

HLAR的临床意义：对高浓度氨基糖苷类敏感，表示氨基糖苷类与作用于细胞壁的抗菌药物联合用药时对该肠球菌菌株将具有协同作用，也是敏感的。对氨基糖苷类高水平耐药，表示当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果。

万古霉素耐药肠球菌的检测。要想使用纸片扩散法准确检测出耐万古霉素肠球菌，需要将平板孵育满24小时而不是16到18小时,借透射光仔细检查抑菌圈内有无细小菌落或弥漫生长。纸片扩散法结果为中介度也就是在8到 16毫米 时应选MIC值。可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行MIC值的检测。

筛选试验，用每毫升6个微克万古霉素的脑心浸液琼脂筛选试验，35加减2度，大气环境孵育24小时，点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。

青霉素耐药肺炎链球菌的检测。一，肺炎链球菌的耐药机制，青霉素耐药肺炎链球菌的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白发生改变，改变后使PBP与青霉素的结合力下降，因而导致耐药。

二，纸片扩散法检测。方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片而不是青霉素纸片，来检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性。培养基用 MH 琼脂加5%绵羊血。接种物，使用绵羊血琼脂平板上过夜生长的菌落制备接种物，采用直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育，35加减2度，在5%二氧化碳环境，孵育20到24小时。结果判读，苯唑西林大于等于 20毫米 对青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19毫米 时，应测定青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和美罗培南的MIC值。质控菌株用肺炎链球菌 ATCC 49619。

结果报告，当苯唑西林抑菌圈大于等于 20毫米 时可报告肺炎球菌对青霉素敏感，并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感，而不需要再检测这些药物的敏感性。当苯唑西林的抑菌圈直径小于等于 19毫米 的菌株应当检测青霉素、头孢噻肟或头孢曲松及美罗培南的MIC值，因为抑菌环直径小于等于 19毫米 时，可以发生在青霉素耐药、中介或敏感的某些菌株中，不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环直径小于等于 19毫米，就报告对青霉素耐药或中介。

肉汤稀释法检测。方法，用加2%到5%融血马血的调节阳离子M-H肉汤做肺炎链球菌的稀释法药敏试验，35加减2度，大气环境孵育20到24小时，琼脂稀释法应放在二氧化碳环境下孵育。结果判读，一，口服青霉素V，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克时为敏感，MIC 值大于等于每毫升2个微克为耐药。二，青霉素注射液，脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克为敏感，MIC 值大于等于0.12每毫升微克为耐药。非脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值大于等于每毫升8个微克为耐药。质控菌株，肺炎链球菌ATCC 49619。

第二部分，β-内酰胺酶介导的革兰阴性发酵细菌的耐药机制检测。革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素的主要耐药机制，一，产生 β-内酰胺酶水解灭活药物；二，细菌外膜通透性下降；三，主动泵出药物。其中产生 β-内酰胺酶是革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。

临床上重要的 β-内酰胺酶有以下几种：一，超广谱 β-内酰胺酶，也就是ESB L ；二，头孢菌素酶，也就是AmpC酶；三，碳青霉烯酶，主要包括KPC酶。

超广谱 β-内酰胺酶的检测。CLSI根据PK-PD性能评价和有限的临床资料，首次于2010年1月也就是 CLSI M100-S20文件修订了头孢菌素和氨曲南的解释标准。因此，在使用新修订的解释标准时不需要常规检测ESBL，除非是在使用旧的解释标准或者是为了流行病学调查以及感染控制的目的仍需要检测ESBL。初筛试验，按常规的标准呢纸片扩散法进行操作对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌，如果下列纸片抑菌圈直径，提示菌株可能产生 ESBL。对奇异变形杆菌抑菌圈直径和上述菌有所不同。

按常规的标准肉汤稀释法进行操作。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌判断标准：头孢他啶、氨曲南、头孢曲松或头孢噻肟任何一种药物对的MIC值大于等于每毫升2个微克，头孢泊肟 MIC 值大于每毫升8个微克，提示菌株可能产生 ESBL。奇异变形杆菌判断标准：头孢泊肟、头孢他啶或头孢噻肟MIC值大于每毫升2个微克，提示菌株可能产生ESBL。

双纸片协同法。按照常规的纸片扩散法在MH琼脂上涂布好受试菌，先在琼脂平板中心贴上阿莫西林加克拉维酸纸片，然后在其上下左右贴上头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南纸片，各纸片中心距复合纸片中心距离为20到 30毫米，35加减2度，大气环境孵育16到18小时。结果解释，如周围4个药物纸片，其中任何一个抑菌圈在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强，说明该菌株产ESBL。

扩散法质控，ESBL阴性质控用大肠埃希菌ATCC 25922。ESBL阳性质控肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

微量肉汤稀释法初筛试验。方法用调节阳离子M-H肉汤，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌选用，头孢他啶每毫升1个微克，氨曲南每毫升1个微克，头孢曲松每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。奇异变形杆菌选用头孢泊肟每毫升1个微克或头孢他啶每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。35加减2度，大气环境孵育16到20小时。结果判断如果生长提示菌株产ESBL。注意事项，使用一种以上的药物进行检测可提高检测的敏感性。质控菌株，ATCC 25922不太明显；肺炎克雷伯菌ATCC 700603的生长平等。

ESBL表型确证试验。纸片扩散法，使用每片含30微克的头孢他啶、头孢噻肟和头孢他啶加克拉维酸、头孢噻肟加克拉维酸的复合剂纸片进行试验，当任何一种复合纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径 5毫米，可确认该菌株产ESBL。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922小于等于2个毫米，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，头孢他啶加克拉维酸大于等于 5毫米，头孢噻肟加克拉维酸大于等于 3毫米。

表型确认试验。琼脂稀释法：使用头孢他啶 MIC 范围在0.25到128每毫升微克、头孢他啶加克拉维酸范围在0.25到4，128到4每毫升微克、头孢噻肟和头孢噻肟加克拉维酸进行MIC测试，当与克拉维酸联合用药，MIC小于或等于单独用药药物MIC 3个倍比稀释度，也就是8倍浓度，可确认该菌株产ESBL。

稀释法质控，ESBL阴性质控，大肠埃希菌ATCC25922；ESBL阳性质控，肺炎克雷伯菌ATCC700603。

头孢菌素酶检测，对于头孢菌素酶，CLSI酶目前还没有可供推荐的方法进行检测，也没有相应的判断标准。目前用于头孢菌素酶定性的检测方法很多，主要有以下几种。一，单纸片扩散法；二，双纸片协同法；三，双纸片增效试验；四，三维试验法。

碳青霉烯酶的测定。碳青霉烯酶定义，指所有能水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类 β 内酰胺酶，分别属于Ambler分类A类、B类、D类酶，包括KPC β 内酰胺酶和金属酶。CL SI目前还没有可提供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法，但是2009年的CLSI M100-S19文件中增加了对KPC β 内酰胺酶的检测方法，即改良的三维方法，即改良的测序试验。

KPC酶检测。2001年首次报道从肺炎克雷伯中分离到KPC-1，它属于Bush分类法中的Ⅱ类 2f 组，Ambler分子分类中的属于A类,克拉维酸对其活性有抑制作用。KPC β 内酰胺酶目前已有10种亚型，包括KPC-1至KPC-10，他们之间只有个别氨基酸发生了突变。在多个菌属中都有报道。主要为质粒介导，但在阴沟肠杆菌中可由染色体介导。国外报道，产KPC β 内酰胺酶菌株即可表现为对碳氢霉烯类抗生素耐药，也可表现为中介或敏感，并存在接种效应，这就增加了对其识别的难度。

用于KPC酶定性的检测方法主要有以下几种：一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验；二，改良三维试验法；三，分子生物学方法。

纸片筛选法，选用厄他培南、美罗培南，亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选用药物。一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验。方法，将0.5麦氏单位的浓度待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，琼脂稍干后，把含每片600微克的3-氨基苯硼酸纸片贴于MH平板中间，于纸片周围分别贴上含厄他培南和美罗培南纸片，纸片中心距离为 20毫米，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时，有协同现象出现为MBL阳性。

改良的Hodge试验。改良 Hodge 试验是碳青霉烯酶表型检测方法，用于检测KPC的敏感性以及特异性均大于90%，但检测其他碳青霉烯酶时，敏感性及特异性变化较大。方法，将0.5麦氏标准浓度的大肠埃希菌ATCC 25922菌液经1:10稀释后涂抹于MH琼脂平板上，待琼脂稍干后，贴一片厄他培南或美罗培南纸片于平板中央，直径为 90毫米平板可贴1张纸片，直径为 150毫米平板可以贴4张，用接种环刮取待检菌沿底物纸片边缘向外划直线接种，每张底物纸片可测试1株待检菌株和2株质控菌株，划线至少20到 25毫米 长，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时。出现失状菌苔者为阳性，反之为阴性。

质量控制，每次试验需检测阳性和阴性质控菌株；阳性菌株用肺炎克雷伯菌 ATCC BAA —1705，阴性菌用 ATCC BAA —1706。

根据CLSI于2010年6月也就是M100-S20-U文件首次公布的新的碳青霉烯类解释标准，常规试验不再需要初筛试验和确认试验，为了流行病学调查或感染控制目的测试菌株可使用MHT，但对于MHT阳性菌株不需要更改碳青霉烯类敏感试验结果的解释。

金属 β —内酰胺酶的测定。定义，活性部位带金属离子的酶称为金属 β-内酰胺酶，这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他 β —内酰胺类抗生素。巯基化合物对金属 β-内酰胺酶的抑制作用强于EDTA，但其毒性作用较强，因此用EDTA进行检测更安全。

用于金属酶定性的试验方法主要有以下几种：一，EDTA双纸片协同及增效试验；二，三维试验法；三，分子生物学方法。

BLNAR流感嗜血杆菌的检测。定义，BLNAR取字头，意为 β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药主要机制是产生 β-内酰胺酶，以质粒介导的TEM-1型酶为主，少部分产ROB-1型酶。B LNAR流感嗜血杆菌的耐药机制主要是由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致。

对于这类菌株的检测，常规实验室一般采用氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸双纸片结合的方法，如果K-B药敏结果显示氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸均耐药，提示该菌可能为BLNAR流感嗜血杆菌菌株。国外学者研究发现，相对于常规检测方法，低浓度含量的氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸纸片检测此类菌株，效果可能会更好。B LNAR流感嗜血杆菌被认为对阿莫西林加克拉维酸、氨苄西林加舒巴坦、头孢克罗、头孢他美、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢孟多、氯碳头孢和哌拉西林加他唑巴坦耐药，即使某些BLNAR菌株对上述药物体外实验显示敏感。