第一篇：pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究论文
应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白，参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程。pmCherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。2015年9～11月，本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pmCherry-C1载体，构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒，旨在为深入研究Argonaute1蛋白的细胞生物学功能提供便利工具。
1材料与方法
1.1材料质粒、菌株及细胞:pmCherry-C1载体由JohanPerane博士馈赠，感受态大肠杆菌Trans1购自天津科仪嘉欣科技有限公司，HeLa细胞来自本实验室。酶类及主要生化试剂:限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA连接酶均购自ThermoFisherScientific公司，Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术公司，T/A载体(pEASY-T1)购自北京全式金生物技术有限公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司，LumiGLo化学发光底物购于KPL公司。抗体:兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST公司，鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1α抗体购自abcam公司，鼠抗人樱桃红蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL公司，蓝色荧光(AlexaFluor350)标记的驴抗鼠荧光二抗和绿色荧光(AlexaFluor488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen公司，辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔IgG二抗购自KPL公司。引物合成及基因测序由北京天一辉远公司完成。
1.2pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒构建
1.2.1Argonaute1蛋白目的片段获取提取HeLa细胞的总RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列进行Argonaute1的cDNA扩增;根据CDS序列(NM012199.2)设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反转录的Argonaute1cDNA为模板，扩增PCR目的片段，条件为95℃预变性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15个循环，每次循环降低1℃，再以50℃进行20个循环，72℃延伸10min;将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，并将目的片段与pEASY-T1(T/A载体)于25℃连接15min。连接产物转化Tran1-T1感受态细胞，置于含有氨苄/卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。
1.2.2线性pmCherry-C1质粒载体获取以质粒快速小提试剂盒提取pmCherry-C1质粒，进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，完整切下呈线性的pmCherry-C1质粒载体，以1%琼脂糖电泳分离，再以凝胶回收试剂盒回收pmCherry-C1线性载体(约4700bp)。在T4DNA连接酶作用下，将线性pmCherry-C1质粒载体与具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下连接并过夜。连接产物转化感受态细菌大肠杆菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。
1.3pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒鉴定
1.3.1酶切及基因测序采用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1进行单、双酶切鉴定，并以1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小;同时对重组质粒进行基因测序鉴定。
1.3.2融合蛋白检测采用Westernblotting法。以预冷的1×NP-40裂解液裂解细胞，超声破碎细胞后4℃、12000r/min离心10min，取上清获取全细胞裂解液，以BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液中加入SDS上样缓冲液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、2.5%β-巯基乙醇)，99℃热变性10min，8%SDS-PAGE电泳;以半干转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭3h;加入兔抗人Argonaute1单克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育过夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG二抗室温孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化学发光底物后暗室曝光。
1.3.3三色荧光共定位分析以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。将细胞接种于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞达80%融合时，进行脂质体瞬时转染pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒。转染后48h给予0.5mmol/L亚砷酸盐处理1h，以4%多聚甲醛室温固定10min，以高压过的PBS缓冲液洗涤2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室温静置通透10min;加入1%BSA封闭1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育过夜;PBS洗涤3次，10min/次;加入蓝色荧光标记驴抗鼠(1∶800)与绿色荧光标记驴抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育过夜;PBS洗涤3次，10min/次。以不含DAPI的细胞荧光封片液封片并过夜，以激光共聚焦显微镜观察细胞内红、绿、蓝三色荧光信号。
2结果
2.1Argonaute1目的片段PCR扩增目的片段长度约为2574bp。
2.2线性pmCherry-C1质粒载体完整的线性pm-Cherry-C1质粒载体经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后，在4722bp左右出现条带，纯化回收后用于后续的连接反应。
2.3重组真核表达质粒pmCherry-C1-Argonaute1鉴定结果
2.3.1酶切及基因测序将构建的重组质粒分别进行EcoRⅠ和BamHⅠ的单、双酶切，产生的条带大小与预期相符，重组质粒基因测序结果正确，证明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位点上。
2.3.2融合蛋白表达Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量为89.7KDa，Westernblotting法检测的蛋白条带与目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表达成功。
2.3.3三色荧光共定位转染构建的重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在细胞内发现荧光信号，当细胞受到氧化应激时Cherry-Argonaute1可在胞质内形成红色的颗粒状结构，与SGs的标志蛋白G3BP(蓝色)、PBs的标志蛋白DCP1α(绿色)颗粒结构均呈共定位关系。
3讨论
Argonaute1蛋白家族是一类相对分子量约为100KDa的序列保守蛋白，表达于人、果蝇、拟南芥等多个物种。Argonaute1蛋白家族包括多个成员，多含有月牙状的PAZ和具有潜在核酸内切酶活性的PIWI结构域，参与miRNA、siRNA、piRNA等多个非编码小RNA的细胞生物学过程。研究发现，Argonaute1是RNA诱导沉默复合体的核心元件，与siRNA生成、靶mRNA降解、细胞应激等过程密切相关。生物体的生存环境复杂多变，机体细胞为应对氧化应激、渗透压休克、热休克、紫外线辐射和病毒感染等多种外界刺激而建立相应的“应激反应体系”，以保持细胞旺盛的生命力。转录后基因调控机制是其中至关重要的环节，它可调控胞质内RNA代谢、暂时抑制应激细胞中蛋白的翻译过程、节省细胞内合成代谢的原料和能量、优先表达应激所特需的蛋白等。SGs和PBs是细胞受到应激时在胞质内形成的与RNA代谢密切相关的颗粒状结构。这两种颗粒结构实质上是一系列蛋白、核酸的聚集体。随着研究的深入，不断有新的应激蛋白被发现。
其中，Argonaute1蛋白同时参与细胞中SGs和PBs的形成。通过基因工程的方法对Argonaute1蛋白进行荧光蛋白标记，可用于探讨Argonaute1蛋白在细胞应激中的作用。Cherry是四聚体Discosomasp.红色荧光蛋白的一个突变体，荧光强度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1载体允许目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成红色荧光标记的目的蛋白。本研究通过构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的方法对Argonaute1蛋白进行Cherry的荧光标记。在Westernblotting实验中发现，利用抗内源性Argonaute1抗体可以检测出两个条带，而抗Cherry抗体检测出一个条带，表明pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒能够在活细胞内成功表达Cherry与Argonaute1的融合蛋白。当细胞受到亚砷酸盐氧化应激刺激时，Cherry标记的Argonaute1蛋白可与应激颗粒(以G3BP蛋白为标记蛋白)和加工体(以DCP1α为标记蛋白)均呈共定位关系，说明Argonaute1蛋白为细胞应激和加工体的共同成员。
总之，本研究成功构建了重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒，其可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白;上述结果有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病研究领域的生物学作用机制。
第二篇：重组质粒的构建经验~~~
昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下： 1)克隆基因的酶切位点问题 2)载体酶切的问题 3)连接片段浓度比的问题 在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DNA片段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和DNA片段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DNA片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。最后他责备本人暗中保留一手，没
有倾攮相授。呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵，你说冤不冤？这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题 一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“
一、二”，16℃ 10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法： 1． 取一平皿。
2． 薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。3．平皿背面可以画成小方格。4． 一小格中点1 ul样品。5． 另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng)6． 凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。
第三篇：基因重组质粒的构建与抽提
基因重组质粒的构建与抽提
摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料与仪器、用品.........................................................................................................................2 2 原理与方法......................................................................................................................................3
2.1 获取目的基因.......................................................................................................................3
2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反转录为cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶链式反应......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5
2.2.1 核酸电泳....................................................................................................................5 2.2.2 胶回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子体外连接.............................................................................................................7 2.4 转化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鉴定质粒.......................................................................................................................8 3 讨论...............................................................................................................................................10 3.1试剂.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸电泳缓冲液...............................................................................................................11 3.4 胶回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位点..................................................................................................................11 3.6 转化效率............................................................................................................................11 3.7 试剂盒................................................................................................................................12 参考文献...........................................................................................................................................13 致谢....................................................................................................................错误！未定义书签。附录....................................................................................................................................................14
Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10
3.1 Reagent................................................................................................................................11
3.2 Nuclease..............................................................................................................................11
3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11
3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11
3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11
3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11
3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10
引言
自噬是一种实现细胞本身代谢需要和某些细胞器更新的生命活动，该活动对于动物机体生长发育具有重要意义。自噬相关基因LC3通过与细菌质粒结合可以大量复制。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。不同微管之间的差异，主要与结合于微管的非微管结构蛋白有关，它们参与微管结构的组装，维持微管的稳定LC3和微管与其他骨架纤维之间的连接，表现为广泛的功能性作用，该类蛋白被统称为微管相关蛋白，LC3即微管相关蛋白轻链3，作为动物机体的一个自噬相关基因，对于其自噬活动相关微管蛋白质表达具有重要意义，目前国内外对该基因研究逐步增多、不断深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 调控对巨噬过程是至关重要的,因为蛋白质LC3-II定位自噬前体和自噬小体,它被认为是一个自噬标记，在其对两性哈德氏腺的实验中，免疫印迹分析显示了LC3-I和LC3-II两个对应波段[1]；Hanqing Dong等的发现表明,LC3 结合可能发生在脂滴表面,导致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候选识别是脂滴-相关蛋白质；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章叙述了选择性自噬最有特性的基质是p62,它也被称为死骨片1 / SQSTM1，p62是广泛表达的细胞蛋白质,在动物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通过LC3-作用区域p62直接与LC3相互作用[3]。此次实习实验过程中，将该基因作为目的基因，采用基因克隆技术构建重组基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成为相关研究、实验的组成环节，例如用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学检验，以及动物机体蛋白质表达控制研究、自噬研究等。
质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子，即细胞附殖粒、又称胞附殖粒。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中，总体多为原核生物。构建重组质粒指将目的基因，即外源基因，与具有自主复制能力的载体在体外人工连接，构建成新的重组DNA，随后抽提质粒可以将目的基因与细菌DNA分离，以获得高纯度的目的基因。笔者通过实验学习、实际动手操作，完成了此质粒的构建和抽提过程，并在文中阐述了获取目的基因后而进行的LC3基因克隆过程，其中使用GFP、RFP载体构建质粒。基因克隆又称为分子克隆，指采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子的过程。其是七十年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可简要叙述为分、切、连、转、选五个步骤。其最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制，即把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入细菌中，建立基因克隆体系。本实验构建含GFP-RFP-LC3基因的重组质粒，GFP、RFP分别为绿色和红色荧光基因；使用的T载体为克隆载体，符合基因工程的载体应具有的基本性质，包括在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，使外源重组的DNA片段得以扩增；分子量小，利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段，且在实验操作中也不易被机械剪切而破
[2]
坏；载体分子中具有两个以上的容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞的不同表型特征；载体具有较多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质，最终获得高纯RNA产物的过程，目前，国内外提取RNA的技术均比较成熟，生产出的有关试剂盒利用分子量比较大的有机溶剂氯仿使有机相和无机相迅速分离，初步获取RNA，并进一步分离纯化。提取RNA后将其反转录并扩增，即可获得用于重组质粒的目的基因。重组质粒过程中利用了聚合酶链式反应（PCR）、琼脂糖凝胶电泳等方法。聚合酶链式反应是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术，它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生微克量的PCR产物。琼脂糖凝胶电泳以琼脂凝胶作为支持物，利用核酸分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。重组质粒构建后，使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒，本实验采取的离心法抽提质粒，即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最后将得到的质粒送至有关生物公司测序，测序结果分析表明，目的基因片段存在于送检样品中，说明实验成功构建并获取了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒。材料与仪器、用品
鸭肝脏组织，液氮，75%酒精，无水乙醇，氯仿，蒸馏水，普通双蒸水，琼脂糖，50倍浓度商品化TAE，2000bpDNA标准参照物（Marker），填充剂（Loading）,氨苄霉素，LB培养液，E.coli DH5a 菌株。
美国Omega RNA提取试剂盒，包含HiBin微型制备管，2毫升收集管，RNA-Solv试剂，RNA Wash 缓冲液 I，RNA Wash 缓冲液 II，DEPC水等。
AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂盒中的试剂包括小量制备 制备管, 2毫升 微量离心管,1.5毫升 微量离心管, RNA酶 A, 缓冲液 S1, 缓冲液 S2,缓冲液 S3,缓冲液 W1, 缓冲液 W2 浓缩液，Eluent洗脱液。
AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂盒中试剂包括缓冲液 W1，缓冲液 W2浓缩液，缓冲液 DE-A，缓冲液 DE-B，Eluent洗脱液。
RNA引物混合液，包含模版RNA，随机引物，无RNA酶双蒸水等。
反转录反应液，包含模版RNA引物变性溶液，随机引物，5倍浓度M-MLV 缓冲液，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，RNA酶M-MLV，无RNA酶双蒸水。
一次性口罩，一次性手套，实验工作服，超净工作台，恒温培养箱，制冰机，研钵，移液器，枪头，无DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制备管，离心机，恒温水浴锅，振荡器，冰盒，酒精灯，蒸馏设备和用品（50毫升烧杯，蒸馏头，100℃温度计，冷凝管，接引管，三角瓶，铁夹，铁环，酒精灯，沸石，50m量筒，铁架台），PE管，PCR仪，锥形瓶，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，电泳仪电源，记号笔，卫生纸，玻璃涂棒。原理与方法
2.1 获取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是将细胞破碎裂解，利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和DNA的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终得到纯净的RNA的过程。影响RNA提取质量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶无处不在，包括破碎细胞内的RNA酶,实验室空气、实验台上的酶，实验所用试剂中的酶,实验人员身上携带的酶以及实验器材的污染等等，而且RNA酶性质稳定，实验室很难做到完全隔离这个酶的作用[4]。RNA提取试剂盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因为RNA样品中易残留RNA酶的变性剂异硫氰酸胍和β-巯基乙醇，细胞裂解不彻底，导致核糖核酸不能完全释放出来。另外，有些细菌的细胞壁坚韧，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。
本实验使用美国Omega RNA提取试剂盒。实验前，酒精充分消毒实验台、实验室空气，戴棉手套取适量液氮置于保温瓶中，将用酒精冲洗过的研钵泡入液氮中，同时将鸭的肝组织泡入液氮中，待两者充分冷冻，在研钵中研碎鸭肝组织。
操作步骤包括取适量组织粉末置于无DNA酶和RNA酶的收集管中，离心，5000转/分钟，5分钟，4℃。加1毫升RNA-Solv试剂，振荡混匀，室温孵化3分钟。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv与组织混合液加0.2 毫升氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，冰上孵育10分钟。随后4°C，12000转/分钟，离心10分钟，离心后混合物分三层，RNA存在于最上层水相。将五分之四的RNA水层置于新的收集管，加三分之一收集管的无水乙醇。轻微混匀并离心后，小心吸出不大于700 微升的上层RNA水层液体于无RNA酶的制备管中，振荡混匀沉淀，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。重复上一步骤，再次离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。将制备管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 缓冲液 I，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 缓冲液 II，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液，随后用空收集管离心，13000转/分钟，2分钟，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于超净台上晾5分钟；或将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分钟。最后洗提RNA，将制备管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，确保加入到制备管中央，随后室温静置2分钟，离心，13000转/分钟，1分钟，20℃。得到的RNA保存在超低温冰箱。2.1.2 RNA反转录为cDNA 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶催化,以dNTP为原料，合成DNA的过程，是DNA
生物合成的一种特殊方式。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶，即以RNA为模板催化DNA链的合成，合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程[
6、7]。
操作步骤包括收集管中配制模版RNA引物混合液，为6微升体系，包含模版RNA2微升，随机引物1微升，无RNA酶双蒸水3微升。70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。离心数秒种使模版RNA引物的变性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反转录反应液，为10微升体系，包含上述模版RNA引物变性溶液6微升，随机引物1微升，5倍浓度M-MLV 缓冲液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制剂0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，无RNA酶双蒸水0.75微升。因为本实验使用随机引物，所以先于30℃恒温水浴锅保温10分钟，然后42℃保温60分钟。70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA做好标记并保存于超低温冰箱。2.1.3 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，它的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶链式反应是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制以得到多量脱氧核糖核酸[
9、10]。
本实验第一次聚合酶链式反应是用两对引物分别扩增cDNA为DNA,目的是判断哪一对引物扩增效果好，选择其进行DNA扩增。准备步骤包括制作双蒸水，首先取蒸馏水200 微升，于超净台点燃酒精灯，安装设备对蒸馏水再次蒸馏，PE管分装后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭双手，禁用双手触碰PE管口。RNA引物获取，是将目的基因送至博士生物公司，由其进行引物的设计与合成；合成的引物经过真空冷冻干燥，呈薄膜状附在离心管中，盛有引物的离心管经过离心后开启，随后加入规定量的双蒸水合上管盖充分振荡使其溶解，备用。
操作步骤包括准备四个PE管，并分别标记为1-
1、1-
2、2-
1、2-2，将两对引物分别加入两个模版中，配制25微升体系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，双蒸水11微升。将所有PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留混合液，随后摆到双面板上；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，打开电源开关，设置运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，4℃、保存时长，循环30次。
2.2 回收目的基因
2.2.1 核酸电泳
核酸电泳，其中利用了琼脂糖凝胶，琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度[11]。将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA[12]，一般来说，需要分离的目的基因片段越大，琼脂糖浓度越小，凝胶密度越小，反之亦然。样品加入量加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散。每孔点样的体积一般少于25微升，吸取每一个样品时，操作需谨慎，没有颜色的样品需要加入填充剂。另外，电泳系统须加入适宜DNA标准参照物进行判定，过大或过小的标准参照物姐不利于判定结果。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳准备步骤包括核酸用琼脂糖凝胶制作，配制1%的琼脂糖凝胶，首先称取1.000g琼脂糖加入锥形瓶中，倒入100毫升电泳缓冲液TAE(50倍浓度TAE20毫升加1升水，混匀)，摇晃混匀后用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热两三分钟，在水龙头上冲凉冷却至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此过程中注意自身防护。同时用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子，将配好的琼脂糖凝胶液体倒入电泳槽，凝固约20分钟。溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块，倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
将完全凝固的琼脂糖凝胶放置在加有缓冲液的电泳槽，缓冲液一定要没过凝胶，由负极到正极电泳；琼脂糖加样时用移液抢将样品加至点样孔，动作稳重注意不要戳破凝胶导致滤液，点样是每孔加50微升样品混合液，标准参照物加10微升；接通电泳仪电源，调节电流为120A，电压为120V，开始电泳；约20分钟后样品跑到五分之四凝胶宽度，取出电泳胶，观察结果，以确定扩增目的基因引物为第一对或第二对(图1)。
图1 引物选择PCR结果
Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 胶回收
cDNA扩增引物选择结果显示引物2的扩增效果较引物1好，因此选择引物2进行目的基因扩增。加入第二对引物进行第二次的聚合酶链式反应扩增DNA并回收产物，扩增使用高保真的连接酶。配制50微升体系，每管加入缓冲液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，双蒸水24.3微升，随后将PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，10℃、保存时长，循环40次。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，配胶过程同上，点样时，每孔加50微升样品混合液和5微升Loading，然后接通电泳仪电源，调节电流为120Ma，电压为120V，开始电泳。约20分钟跑胶完成，观察结果（图2）。为对琼脂糖凝胶电泳的某一核酸条带做进一步分析，可对DNA进行胶回收
[
13、14]。
图2 cDNA扩增结果
Figure 2 cDNA amplification results 本实验使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对目的片段切胶回收。准备步骤包括缓冲液 W2浓缩液中加入一定体积的无水乙醇，原因是此为第一次使用凝胶回收试剂盒。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。准备75℃水浴。试用前，检查缓冲液 DE-B是否出现沉淀，如出现应于70℃水浴加热并溶解。
操作步骤包括戴上防护帽在紫外灯下切下含有目的基因的DNA的琼脂凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎，计算凝胶重量，用加入凝胶后称量重量减去提前记录的1.5毫升离心管重量，该重量作为一个凝胶体积。加入3个凝胶体积的缓冲液 DE-A，混合均匀后于75℃加热，每而两三分钟间断混合，直至凝胶完全融化。加0.5个缓冲液 DE-A体积的缓冲液 DE-B，混合均匀。吸取上一步中的混合液，转移到DNA制备管，制备管置于2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加500毫升 缓冲液 W1，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加700毫升 缓冲液 W2，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。以同样的方法加700毫升缓冲液 W2洗涤一次，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。将制备管置于洁净的1.5毫升离心管中，在制备膜中央加30微升 Eluent或去离子水，室温静置1分钟，离心，12000转/分钟，1分钟，洗脱DNA。得到的DNA保存至超低温冰箱。2.3 DNA分子体外连接
本实验采用卡那霉素抗性T载体连接，此步骤即重组DNA分子，为目的基因导入细菌细胞并复制的必要条件。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h过夜，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
T载体连接操作时，首先于小PCR管中配制50微升体系，包括Solution I 5微升，回收产物4.5微升，T载体0.5微升。随后混匀并于16℃连接过夜，连接时间至少8小时。2.4 转化
外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过抗生素筛选法筛选出重组子，并可通过限制性核酸内切酶酶切，电泳，根据DNA Maker标准判断阳性重组子中是否含有目的基因。感受态细胞制作原理为细菌在0°C氯化钙低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态[15]。转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，即原核细胞或者真核细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法[16]。基因克隆中的转化过程原理为质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，可以在含抗菌素的培养基中生长，从而鉴别选择出转化子。
准备步骤包括配制LB培养基、LB固体培养基、含抗生素LB培养基。首先，每升LB培养基，需在超纯水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，溶解混匀；LB固体培养基是在每升LB培养基中加入15克琼脂糖，混匀加热溶解；制作含氨苄霉素培养基，称量固体LB微波炉加热3分钟，冲冷水至不烫手，按1：1000比例加入氨苄霉素，倒薄薄的一层于培养皿中，待其凝固，盖上培养皿盖子，倒置并标记。
操作步骤包括准备冰盒，打开42℃水恒温浴锅，将无抗LB提前放入37℃预热；从超低温冰箱取出E.coli DH5a 感受态菌株，将商品化DH5a 感受态细胞快速且温柔取于冰中，待其于冰中融化；在超净工作台作业，吸取10微升载体连接产物，缓慢加入感受
态中，反复抽吸三次混匀，动作需轻微，防止产生气泡，放入冰盒30分钟；将样品放入42℃中热激90秒，此为转化必须环节；冰浴2分钟，使其停止转化过程；将预热的无抗LB8微升加入样品中，放入摇床45分钟至60分钟，复苏感受态细胞；将涂菌棒用酒精灯灭菌，从冰箱取出培养基放入37℃温箱预热；将摇好后的样品4000g离心5分钟，弃去上清600微升，余200微升，目的是使得细菌浓度升高，将剩余200微升样品混匀，加到培养板上，用灭菌放凉的涂菌棒涂匀；涂菌后的培养基保存于37℃恒温箱过夜。
培养大肠杆菌，在培养基上37℃恒温培养大肠杆菌过夜，长出的菌落呈乳白色大圆点状菌，表面和背面颜色一致，菌落边缘整齐均匀，表面光滑湿润,分散分布于整个培养皿（图3）。随后挑菌、摇菌、获得菌液，用于筛选、抽提鉴定质粒。挑菌时在细菌间超净工作台作业，取10只试管标号，依次摆到试管架上，灼烧试管盖和镊子，用镊子拔下试管盖后，在此灼烧试管口和试管盖，倒入约三分之一的氨苄抗性LB，用镊子夹枪头挑去细菌，连同枪头扔进试管，灼烧管口和试管口，在火焰中盖上试管盖。摇菌是在37℃摇床，过夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。
图3 转化后大肠杆菌培养结果
Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鉴定质粒
质粒是在细菌细胞中染色体之外能够自主复制的共价闭合环状双螺旋的分子或遗传因子。质粒抽提原理即去除 RNA，且将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒[
17、18]。
本实验采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。
准备步骤包括RNA酶 A全部加入缓冲液 S1中并4℃贮存。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。缓冲液 W2浓缩液中加入指定体积的无水乙醇，原因是第一次使用试剂盒。试用前，检查缓冲液 S2是否出现沉淀，如有沉淀应于37℃水浴加热并溶解。
操作步骤包括取2毫升在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转/分钟,离心1分钟，弃尽上清。加250微升缓冲液 S1悬浮细菌沉淀，悬浮需要均匀，不能够有小的菌块，确认缓冲液W2中已加入无水乙醇。加250毫升，温和并充分地上下翻转6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤需要控制在5分钟之内。使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的和中的中和，降低溶菌效率。避免剧烈摇晃，否则可能导致基因组DNA的污染，此步骤需要控制在5分钟之内。采用离心法纯化质粒，吸取上一步骤中的离心上清并转移到制备管，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回离心管，加500微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回2毫升离心管中，12000转/分钟,离心1分钟。将制备管移入新的1.5毫升离心管中，在制备管中央加80 微升的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，12000转/分钟,离心1分钟，将Eluent或去离子水加热至65℃能提高洗脱效率。随后，质粒测序鉴定目的基因是否插入。菌液PCR后使用随机引物进行通测，引物合成及测序由北京华大生物公司完成（图4、5）。
图4 质粒基因组碱基序列
Figure 4 Plasmid genome base sequence
图5 质粒基因组测序峰
Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 讨论
本文构建的目的基因LC3有关自噬活动，近年来，自噬在癌症免疫因素感染炎症和神经退行性变等领域的研究不断增加，准确地检测自噬基因对于研究自噬的生物学功能至关重要，根据LC3的特点构建重组质粒，从而获取大量LC3基因可作为自噬研究的组成环节。
本实验采用反转录的方法获取cDNA后，依据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳效果显示第二对引物扩增的条带比较清晰,由此选择第二对引物进行扩增，得到相应目的基因。采用T载体连接方法，将目的基因引入感受态大肠杆菌，进行基因克隆。转化子扩增后，将转化成功的质粒提取出，进行电泳、测序等进一步鉴定。转化后质粒的琼脂糖凝胶电泳结果显示出现约600bp的明亮条带,为目的基因条带，说明目的基因成功导入细菌质粒并复制，进一步的基因测序鉴定结果表明实验完成了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒的构建。最后使用试剂盒提取并纯化质粒，得到多量目的基因LC3。
整个过程的每个环节中皆包含影响实验结果的因素，各个因素稍有变化既可能对实验结果造成量或质的影响，现将需要注意的几个重要因素及其影响讨论如下： 3.1试剂
试剂使用前应当仔细阅读说明书。如用于提取RNA的Omega RNA提取试剂盒，其中的缓冲液 W2 浓缩液在提取开始或贮存在室温条件前，必须用无水乙醇稀释，如果使用了未经处理浓缩液，则无法充分洗涤RNA，使得最后产物中存在大量杂质。3.2 核酸酶
注意保证实验环境中RNA酶量最小化，操作过程应迅速且谨慎，始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具；避免在操作中说话聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新瓶，使用专门配制的无RNA酶制备管、收集管。酶如果没有被充分隔绝，将减少甚至提取不出RNA。3.3 核酸电泳缓冲液
琼脂糖核酸电泳的缓冲系统在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的选择和浓度，而且不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响，凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，否则将导致实验结果参照不准。3.4 胶回收效率
将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间，从而提高回收率；勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外灯对DNA造成的损伤；融化凝胶时应当完全，避免残留降低回收率，以及阻塞制备管滤膜影响后续步骤也会降低回收效率。3.5 DNA酶切位点
基因克隆时选择载体DNA酶切位点时应注意两个酶切位点的距离不应过小，否则影响限制性内切酶识别切点；目的基因片段内部不应含有所选的酶切位点；实验后继应用的所有载体都尽可能含有所选的酶切位点，并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）[20]；选择较常用的酶切位点，两个酶切点至少隔上3个碱基；使用酶切效率高，且双酶切有共同缓冲液的酶。3.6 转化效率
为了提高转化效率, 实验中要考虑细胞生长状态和密度，不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液；细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制，DH5α菌株的OD600 为0.5 时,这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。
质粒的质量和浓度方面应注意用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA，转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低，1纳克的超螺旋态DNA 即可使50微升的感受态细胞达到饱和，一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的二十分之一[
18、19]。
试剂的质量方面应注意所用的试剂,如氯化钙等均需是最高纯度的，并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处；防止杂菌和杂DNA 的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,Tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染[20], 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3.7 试剂盒
本实验使用了若干试剂盒，例如AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、美国Omega RNA提取试剂盒，使操作能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，试剂盒中配备有相应使用说明书，按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果，使用试剂盒时要根据自己的实验需要选取专用提取试剂盒，如果不是专用试剂盒，提出的RNA不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、基因克隆、抽提质粒等后续实验的结果。
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附录1：离心力和离心转速换算计算公式
RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相对离心力，单位为g N表示转速，单位为rpm（转/分）R表示离心半径，单位为cm。
本实验使用的离心机离心力和离心转速换算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf
附录2：试剂稳定性
AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：
RNA酶 A，室温可以贮藏6个月，长期贮存于-20℃；缓冲液 S1为细菌悬浮液，加入RNA酶 A后，混合均匀，4℃贮存；缓冲液 S2为细菌裂解液，室温密闭贮存；缓冲液 S3为中和液，室温密闭贮存；缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2为浓缩液或去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存。的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：
缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2 为浓缩液，又称去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存；缓冲液 DE-A为凝胶融化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解，室温密闭贮存；缓冲液 DE-B为结合液，室温密闭贮存。
第四篇：企业重组研究
企业重组研究
摘要: 企业重组作为优化资源配置的一种手段，一直是资本市场中令人关注的亘古不变的话题。尤其是20世纪90年代以来，随着经济全球化进程的加快，西方国家掀起了席卷全球的第五次兼并重组浪潮。中国企业兼并活动也随之迅速发展，目前，兼并重组已成为我国企业发展壮大、参与国际竞争的重要战略手段之一。随着国有企业改革的进一步深化,企业的兼并、股权转让等活动日益增加,企业重组成为当前经济活动中的热门话题。中国经济结构的调整,国民经济的发展及国有企业的改革都与企业重组息息相关。因此,研究中国企业重组问题有着极其重要的现实意义和理论意义。那么,什么是企业重组?企业重组能否提高企业的效益?企业重组对中国经济实践有何启示？本文围绕着这些问题展开了研究。
关键词:企业重组 问题研究 企业竞争
一．企业重组的现状分析
（一）舍本求末——无视商业准则
管理层为了实现向市场“圈钱”的目的，漠视基本的商业准则，目光只关注短期对外公布会计报表的粉饰，缺乏对长期财务发展的考虑。他们舍弃追求实体经济的利润增长，希望仅靠资本市场的操作，无节制地放大财务杆杠来做大做强，使企业忽视重组过程中的风险控制，内部控制缺失，企业重组后未围绕核心能力和主导产业来实施产业整合。上世纪在资本市场倒塌的德隆系、本世纪美国的“安然”，诱发对上市公司的内部控制信心危机。
（二）缺乏长远规划
决策层对重组战略目标模糊，缺乏长远规划，使重组未能服务于企业战略规划。由于我国企业一般在面临生存危机或是为了进行资本运作时才进行重组，使企业重组多具有紧迫性、被动性，重组前缺乏足够的评估和准备，这样的重组难免步履艰难。那些ST上市公司为了逃避退市命运，慌忙割肉重组，如2008年卖壳失败的ST得亨，2009年4月再次启动资产重组，但终以“流产”告终。
（三）企业重组后内部控制不力
企业重组后由于内部管理接棒乏力，内部控制处于弱势。重组后不能尽快地完成公司治理结构调整，整合资源，重组过程中内部控制执行力乏力。企业在资产重组后，陷入被重组企业的管理泥潭中，导致企业内部出现矛盾与冲突，抵消乃至失去联合重组带来的种种优势，出现1十1<2的不正常现象。TCL并购汤姆逊后，由于执行力不足，TCL的经营理念无法在TTE的欧洲平台上施展，TCL没能在短时间内实现两企业的技术整合和管理整合，致使TCL为这次并购付出了巨额成本。
（四）目标定位脱离实际
中国许多民营企业将资产重组等同于规模扩张，“盲目求太”，重组前后缺乏对市场和自身财务数据准确、全面的收集和分析，重组目标一开始脱离现实基础，背离了企业正常成长的逻辑。1996年上海轮胎的销售收入只有40个亿，1997年在轮胎市场萧条的背景下竟然希望通过资产重组在2000年实现产值100亿元的战略目标。结果一系列并购，全部以巨大的亏损而告终。
（五）缺乏有效沟通
由于缺乏保证信息有效沟通的内部控制机制，致使企业内部对重组目标不明确，执行乏力，反映迟缓，重组没能得到相关群体的充分配合。当企业面临公众信用危机时，企业缺少危机响应和处理的机制，导致企业内外交困，自乱阵脚。
二、企业重组的方式
我国国有企业企业重组主体主要由两个,一个是政府,另一个是企业。根据主体的作用不同,可以将企业重组分为政府主导的企业重组和企业主导的企业重组。
（一）政府主导的企业重组,即行政划拨。
行政划拨就是靠政府的行政手段来实现企业重组。行政划拨是一种非常重要的方式。从理论上讲,政府以行政手段对国有企业进行重组是力所应当的,因为国有经济属于国家,所有者是一元化的,因而可以进行行政划拨。即使是成熟的市场经济国家,也不乏政府对国有企业进行行政性重组的事例。如欧洲客车公司,它是通过英、法两国政府以行政手段,将国有的AerosPatn公司和Bar公司合并为空客公司,从而缔造一个可以同波音公司竞争的大型企业。由于市场经济中,重组往往是市场优胜劣汰力量的结果,但自发重组可能是一个相当长的缓慢过程,对于在国际竞争中处于劣势的国家来说,漫长的自发重组无异于投降认输。
中国的问题是,政府部门进行的重组方案,有时不是从企业效益出发,而是从其他目标出发。例如,政府可能出于社会稳定的目标,将高负债的亏损企业的包袱甩给好企业,造成赢利企业也变为亏损企业。另一个问题是如何处理
重组企业各自利益问题。十几年来,国有企业改革的基本轨迹是允许剩余控制权和剩余索取权为各部门及企业分享,这个措施一方面调动了企业的积极性,另一方面也形成了各自的利益格局。如果行政性企业重组触动到这个利益格局,就会遇到强大的阻力。这样,即使硬性的将很多企业组合在一起,形成一个足够大的公司,企业可能已经失去活性,企业重组也就失去了意义。
（二）企业主导的企业重组,即市场交易。
市场交易就是通过市场的方式进行企业重组。本文根据我国上市公司企业重组的实践,将企业重组根据重组目的不同分为四大方式,即扩张式企业重组、收缩式企业重组、控制权转移式企业重组和内部重整式企业重组。
1.扩张式企业重组
扩张式企业重组通常指扩大套司经营规模和资产规模的一大类重组行为。包括:
购买资产。即购买房地产、债权、业务部门、生产线、商标等有形或无形的资产。收购资产的特点在于收购方不必承担与该部分资产有关联的债务和义务。以多角化发展为目标的扩张通常不采取收购资产而大都采取收购公司的方式来进行,因为缺乏有效组织的资产通常并不能为公司带来新的核心能力。收购公司。收购公司通常指获取目标公司全部股权,使其成为全资子公司或者获取大部分股权处于绝对控股或相对控股地位的重组行为。购买公司不仅获得公司的产权与相应的法人财产,同时也是所有因契约而产生的权利和义务的转让。因此收购公司可以获得目标公司拥有的某些专有权利如专营权、经营特许权等,更能快速地获得由公司的特有组织资本而产生的核心能力。收购股份。一般指不获取目标公司控制权的股
权收购行为,只处于参股地位。收购股份通常是试探性的多角化经营的开始和策略性的投资。或是为了强化与上、下游企业之间的协作关联,如参股原材料供应商以求保证原材料供应的及时和价格优惠,参股经销商以求产品销售的顺畅、货款回收的及时。合资或联营组建子公司。公司在考虑如何将必要的资源与能力组织在一起从而能在其选择的产品市场取得竞争优势的时候,通常有三种选择,即内部开发、收购以及合资。对于那些缺少某些特定能力或者资源的公司来说,合资或联营可以作为合作战略的最基本手段,它可以将公司与其他具有互补技能和资源的合作伙伴联系起来,获得共同的竞争优势。公司的合并。这是指两家以上的公司结合成一家公司,原有会司的资产、负债、权利义务由新设或存续的公司承担。我国《公司法》界定了两种形式的合并:吸收合并和新设合并。从本质上讲这两种形式的合并并没有太大的不同,唯一的区别在于公司名称变与不变。公司合并的目的是实现战略伙伴之间的一体化,进行资源、技能的互补,从而形成更强、范围更广的公司核心能力,提高市场竞争力。同时,公司合并还可以减少同业竞争,扩大市场份额。
2.收缩式企业重组
收缩式企业重组活动,包括:(1)部分经营性或非经营性资产剥离,其中非经营性资产剥离同中国过去“大而全”、“小而全”的企业组织有关;(2)子公司股权剥离;(3)公司股份回购缩股。收缩式重组仅仅限于单纯的资产或股权剥离与回购,资产置换不考虑在内,控制权转移类型的公司剥离资产的行为同样视为该种重组的完整部分,不计入收缩式重组。资产出售或剥离,公司将其拥有的某些子公司、部门、产品生产线、固定资产等出售给其他的经济主体。由于出售这些资产可以获得现金回报,因此从某种意义上来讲,资产剥离并未减小资产的规模,而只是公司资产形式的转化,即从实物资产转化为货币资产。
3.控制权转移式企业重组
控制权转移式企业重组,是指公司控股权的转移,即原第一大股东放弃控股权,新的企业主体以净资产溢价方式有偿取得目标公司控制权或在政府干预下无偿获得国家股从而取得控股股东地位,包括原非控股股东转为控股股东。完整的控制权转移是由两个交易过程构成的:一是收购上市公司控股权,二是上市公司反向收购新的控股股东的资产。中国上市公司控制权转移活动较为复杂。从股权转移是否有明确的支付价格分类,有控股股东所持股权无偿划拨和股权收购两种类型;从收购主体分类,有民营企业和国有或国有控股企业收购上市公司控股股权;从收购方式分类,有国有股或法人股协议转让和二级市场收购。常见的公司控股权及控制权的转移方式有以下几种:
股权的协议转让。即股权的出让与受让双方不通过交易所系统集合竞价的方式进行买卖,而是通过面对面的谈判方式,在交易所外进行交易,因而通常称之为场外交易。这些交易往往出于一些特定的目的,如引入战略合作者,被有较强实力的对手善意收购等。我国的资本市场,场外协议转让案例产生的主要原因在于证券市场中处于控股地位的大量非流通股的存在。
公司股权托管和公司托管。公司股东将其持有的股权以契约的形式,在一定条件和期限内委托给其它法人或自然人,由其代为行使对公司的表决权。当委托人为公司的控股股东时,公司股权托管就演化为公司的控制权托管,使受托人介入公司的管理和运作,成为整个公司的托管。
表决权信托与委托书收购。表决权信托就是许多分散股东集合在一起设定信托,将自己拥有的表决权集中于受托人。使受托人可以通过集中原本分散的股权来实现对公司的控制。委托书收购是一种中小股东影响和控制公司的方法。在股权
结构相对分散的公司里,中小股东可以通过征集其它股东的委托书来召集临时股东大会并达到改组公司董事会控制公司的目的。
股份回购。套司或是用现金或是以债权换股权或是优先股换普通股的方式购回其流通在外的股票。这样会导致公司股权结构的变化,由于公司股本缩减,而控股大股东的股权没有发生改变,因而原有大股东的控股地位得到强化。我国《公司法》对上市公司回购股份有着较为严格的限制,只有在注稍股本或与其他公司合并时方能购回发行在外的股票,并须及时变更登记和公告。
交叉控股。交叉控股是母子公司之间互相持有绝对控股权或相对拉股,使母子公司之间可以互相控制运作。交叉拉股产生的原因是母公司增资扩股时,子公司收购母公司新增发的股份。我国((公司法》规定,一般会司对外投资不得超过净资产的50%,这在一定程度上限制了母子公司间的交叉控股,但亦可以通过多层的逐级控股方式迂回地达到交叉控股的目的。交叉控股的一大特点是企业产权模糊化,找不到最终控股大股东,公司的管理人员取代公司所有者成为公司的主宰,形成内部人控制。
4.内部重整式企业重组
内部业务重整式企业重组是指重整公司主营业务。公司重整主营业务,包括部分资产置入与置出和整体资产置入与置出。部分资产置入与置出即部分资产置换,方法是:交易双方(通常是关联方,即控股公司和重组目标公司)将经过评估的资产进行等值置换,控股公司置入的资产是优质资产,被重组公司置出的则是劣质资产。整体资产置入与置出即整体资产置换,通常发生在控制权转移类型的公司重组中,或公司主营业务无以维系的公司中。
资产置换。这是指公司重组中为了使资产处于最佳配置状态,获取最大收
益或出于其他目的而对其资产负债表的资产类进行交换。由于某种原因,公司一些非核心资产,效率低下,降低了企业的整体盈利能力,而这些资产却又是另一企业所急需的。双方通过资产置换能够获得与自己核心能力相协调的、相匹配的资产。这一过程应是一个互利的双赢过程,而时下国内证券市场上频频出现的所谓资产置换,往往是在政府行为的推动下,旨在买“壳”或借“壳”的一种关联交易行为。在交易过程中,往往是不等价的。
三、企业重组的意义
经过20多年的经济体制改革,我国国民经济的微观基拙得到了很大的完善。但是,随着改革的日益深入,新旧经济体制的冲突越来越尖锐,特别表现在国有企业与市场经济不适应,国有企业出现整体上效益下降,亏损增加现象。如何促进国有资产有效运营,改变国有企业这种越来越困难的局面,成为大家普遍关注的问题。目前,越来越多的人主张加速企业重组,从而重塑社会主义市场经济运行的微观基础。
(一)经济结构调整需要企业重组
当前经济结构的不合理主要表现在基础产业、传统加工业和新一代支柱产业“两头小,中间大”的不合理格局上:一是基础产业的支撑力小。尽管近年来,我国对能源、原材料、运输等基础工业和基础设施加大了投入力度,某些方面的矛盾有些缓解。但从目前情况看,基拙工业总体上仍不能满足整个国民经济的需求。二是以轻纺为主体的传统加工工业能力过大,素质低。80年代以来,传统加工工业生产能力迅猛扩大,但这种迅速增长是一种低水平的扩张,引起传统加工工业在国内市
场陷入严重饱和状态。三是新一代支柱产业带动力小。我国新一代支柱产业和先导产业还比较弱小,不能满足日益增长的国内需要和产业结构升级的要求。我国高新技术产业在工业总产值中所占比重也远远落后于发达国家的水平。由此可见,我国的经济结构调整面临着加强基础产业、改造传统加工业、振兴新一代支柱产业的艰巨任务。调整经济结构,有两种方法。一是增量调整为主的外延式扩张。增量投入一般见效较快,但是,增量投入有很大的局限性。一方面,增量投入往往通过向短线加大投资来调节结构的不合理,从而忽视长线生产力的培养,这样会带来资源的极大浪费;另一方面,靠增量投入这种方式调节经济结构,国家必须有大量的投入。我国增量投入主要是财政和银行,财政现在被巨大的财政赤字所困扰,银行被庞大的不良债务所困扰,因而用增量投入解决结构不合理是不可能的。二是存量调整为主的内涵式发展,即企业重组。我国国有经济中现在仅有1/3的效益比较好,大量的国有资产被闲置或低效益使用。尤其是,这部分存量资产中有很大一部分是变现能力很强的资产,也需要靠存量调整来解决。以存量调整为主,推动资产向优势产业和企业转移,不仅可以大大提高现有的资产利用率,而且也可以带动增量投入结构的优化。靠存量调整解决结构调整问题,就是企业重组问题。因而,从经济结构调整的角度看,企业重组是极其重要的。
(二)国民经济发展需要企业重组
企业重组是我国经济发展的一个新的推动力。改革开放以来,我国的经济发展经历了财政推动,银行推动,到目前转向以资本市场为主的企业重组推动,清华大学魏杰教授称之为三级火箭推动。
从1978年到1986年,这段时间的改革与发展主要靠财政推动,财政是第一级火箭。这一期间,我国进行了价格改革。放开价格后,企业承受不了生产资料涨价,居民承受不了消费品涨价,结果都靠财政补贴。当时企业改革先后进行了放权让利和承包制,最后企业少缴的利税部分都靠财政补贴。财政作为我国改革开放的第一级火箭推动器,起了很大的作用,但也造成巨额的财政赤字。“六五”、“七五”、“八五”期间财政赤字逐年增加。同时,财政用于经济建设的支出大幅下降。真正用于企业经营性资产仅占支出10%左右,财政推动力作用的效果逐渐减弱。从1987年至1994年,银行成为我国改革的第二级火箭。这段时间各种经济成分的发展多靠银行。我国在1987年进行了“拨改货”改革,银行成了主要的资金投入者。我国的国有企业1987年负债率还不到20%,目前负债率平均在80%以上,国有企业的债务急剧增加。这段期间,中国的改革与发展主要靠银行推动,但是,银行也形成了巨大的不良债务。如果再靠银行货款推动经济发展,一旦出现支付危机,金融制度就要崩溃。因此,需要寻找推动经济发展的第三级火箭。第三级火箭,就是企业重组。在目前,我国国有资产中有1/3是闲置的,1/3是低效益使用的,因而,我国的国有资产很大一部分实际上没有充分利用起来。如果通过企业重组,将这一部分资产充分利用起来,中国经济将进入一个新的发展时期。因此,企业重组是寻找一个新的经济发展动力的需要。
(三)国有企业改革需要企业重组
我国的国有企业改革如今已到了关键时刻。国有企业改革能否求得根本性的突破关系着我国未来经济的发展状况,是我国改革进程中极为关键的一个环节。企业重组对推动我国国有企业改革有极其重要的作用,主要体现在以下几个方面。
首先,企业重组可以提高我国企业的竞争力。我国国有企业数量很多,但主要以中小企业为主,有时比较分散,难以形成规模经济,因此很难参与国际竞争。通过
企业重组,可以将企业的优势集中起来,形成一定数量的企业集团,从而增强国有业在国际市场上的竞争能力。这里需要注意的是,虽然企业规模扩大可以提高竞争能力,但是追求盲目的规模扩张对企业发展也是无益的。并且,随着企业规模的扩大,将会产生行业垄断问题,这也不利于我国经济的发展。对于这些问题,本文在后面将进行较详细的阐述。
其次,企业重组可以提高企业的融资能力。国有企业改革和发展都需要寻找新的资金来源。国有企业不能再像传统那样仅靠财政拨款和银行货款来发展普遍关注的问题。目前,越来越多的人主张加速企业重组,从而重塑社会主义市场经济运行的微观基础。
综上所述，企业重组作为优化资源配置的一种手段，一直是资本市场中令人关注的亘古不变的话题。尤其是20世纪90年代以来，随着经济全球化进程的加快，西方国家掀起了席卷全球的第五次兼并重组浪潮。中国企业兼并活动也随之迅速发展，目前，兼并重组已成为我国企业发展壮大、参与国际竞争的重要战略手段之一。因而，本文的研究对于我国今后国有企业重组的理论与实践具有非常重要的意义。党的十六大以来，尤其是十六届四中全会以后，明确提出了构建社会主义和谐社会的历史任务。“民主法治、公平正义、诚信友爱、充满活力、安定有序、人与自然和谐相处”是这一社会的总体特征。当前我国改革与发展进入关键时期，经济体制深刻变革，社会结构深刻变动，利益格局深刻调整，思想观念深刻变化，这一空前的社会变革既给我国发展进步带来巨大活力，也使统筹兼顾各方面利益的任务变得更加艰巨而繁重。在此背景下进行国有企业重组研究，必然具有其特殊意义。
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第五篇：企业债务重组研究
企业债务重组研究
债务重组准则的规定既需要符合国家政策的需要，也需要符合会计信息质量的要求。债务重组中，债权人对其债权作出让步，此时产生了对偿债物资价值、债务重组收入和损失、资产处置收益或损失等的核算与计量问题。我国债务重组会计准则规定，债权人将债务人用于偿还债务的固定资产设备按公允价值计量。然而，债务人用于抵债的固定资产大多是已经使用过的旧固定资产，其入账价值需要遵循谨慎性原则，以成本与市价孰低计价。债务重组过程中产生收益或损失全部计入当期损益，造成了债务人当期利润的虚增，显然是不合理的。
一 债务重组的含义和产生
（一）债务重组的含义
（二）债务重组的产生
（三）债务重组产生的意义
1.债务重组产生对债权人的意义
2.债务重组产生对债务人的意义
二 债务重组的会计处理
（一）债权人的会计处理
1.以债务转为资本清偿债务的会计处理
2.以修改其他债务条件清偿债务的会计处理
3.以组合方式清偿债务的会计处理
（二）债务人的会计处理
1.以债务转为资本清偿债务的会计处理
2.以修改其他债务条件清偿债务的会计处理
3.以组合方式清偿债务的会计处理
三 新旧债务重组准则的比较及新债务重组准则的实施
（一）新旧债务重组准则的比较
1.定义及重组方式比较
2.重组方式比较
（二）会计处理比较
1.计税基础不同
2.损益处理不同
（三）新债务重组实施的原因
1.公允价值计量方面
2.会计处理方法方面
（四）新债务重组实施的利弊
1.公允价值难以取得
2.不利于减少操纵利润现象
3.对债务双方财务有影响
四 债务重组带来的会计问题
1.相关税费处理在债务重组准则中没有明确规定
2.债务重组损益全部计入当期损益不符合权责发生制原则和配比原则
3.债务重组损失的反映违背了一致性原则
4.公允价值的运用缺乏市场基础
5.抵债固定资产入账违背谨慎性原则
五 对债务重组带来会计问题的应对措施
（一）对重组产生的相关税费处理问题的措施
（二）债务重组损益是否一次计入当期损益的处理措施
（三）对重组损益反映在一个会计账户的处理措施
（四）公允价值合理运用的应对措施
（五）固定资产入账价值缺乏谨慎的处理措施
参考文献
［１］刘雪雁．论新旧债务重组准则的差异［Ｊ］宿州教育学院报．２００９．０２［２］尹锋．浅析新准则下的财务重组［Ｊ］宿州教育学院报．２００９．０４
［３］周咏梅．债务重组会计准则存在的问题及改进建议［Ｊ］．中国新科技新产品．２０００９．７：１８７－１８７
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