霉菌毒素总结

第一篇：霉菌毒素总结

霉菌毒素

苏圣华

霉菌毒素是毒性很强的霉菌次生代谢产物，这些霉菌主要属于曲菌属，青霉菌属以及镰孢菌属（Fusarium，Aspergillus，Penicillium及Alternaria species）。据估计，至少有300 种这类真菌代谢物对人类和动物具有潜在毒性，但是为大众熟知并被广泛研究的只有黄曲霉毒素B1（AFB1），玉米赤霉烯酮（ZON），呕吐毒素(DON)，T-2 毒素，赭曲霉毒素(OTA)以及伏马毒素/烟曲霉毒素(FUM)。全球范围内动物饲料、饲料原料和人类食品中都广泛存在霉菌毒素，根据世界粮农组织的调查，世界上每年有25%的粮食受到已确认的霉菌毒素的污染。这些霉菌毒素可以通过被污染的谷物、饲料和由这些饲料喂养的动物所提供的动物性食品（奶、肉、蛋）进入我们的食物链。

一、黄曲霉毒素 1．黄曲霉毒素特点

黄曲霉毒素(Aflatoxin 简称AFT)是一类结构相似的衍生物的总称。目前已发现的AFT 及其衍生物有20 多种,除了AFT B1、B2、G1、G2 是天然产生的毒素外,其余的都为它们的衍生物。在上述4 种天然毒素中,以B1 的毒性最强,在食品和动物饲料的AFT 检测中,一般以B1 作为主要检测指标。

黄曲霉毒素主要是在仓储过程中感染感染产生的。黄曲霉生长繁殖需要一定温度和湿度条件，温度25 ℃ ~30 ℃、相对湿度80%~90% 是黄曲霉最适生长条件。一般南方地区黄曲霉发生率要高于北方，因南方气温和湿度更适于黄曲霉生长繁殖，特别在梅雨季节；因玉米、麦类、稻谷等谷物水分含量为17%~18% 时是黄曲霉生长繁殖最适条件。黄曲霉毒素耐热，只有通过长时间高温（100—120℃）作用，如高压消毒和灼烧才能使其大部分失活；对强酸和强碱较敏感。在提炼油时，用氢氧化钠萃取游离脂肪酸的工艺可以进一步破坏毒素的活性。

黄曲霉毒素以肝脏含量最高,肾、脾、肾上腺亦可检出,有极微量存在于血液中,肌肉中一般不能检出。AFT如不连续摄入,一般不在体内蓄积,一次摄入后约经一周即可经呼吸或由尿粪等将大部分排出。AFB1 在没有经过代谢活化之前的母体化合物是无致癌性的，因此AFB1 被称为前致癌物，因为它必须通过体内的生物转化即“代谢激活或生物激活” 形成活性中间体才具有致癌性。

2、黄曲霉毒素脱毒

AFT 污染粮食的防治原则是以防为主,污染严重的粮食和饲料应该废弃,对于轻度污染的粮食和饲料,则必须认真地进行脱毒处理。霉菌毒素的脱毒可有物理、化学以及生物降解等方法。2.1 化学方法

氨化法

此法是利用塑料薄膜密封被霉菌污染的饲料,然后加氨封闭一定时间,氨与AFTB1 结合后发生脱羟作用,致使AFTB1的内酯环发生裂解,达到去毒效果。一般来说,，对于含毒量在0.2 mg/ kg 以下的饲料采用0.2 %～0.4 %的氨剂量,含毒量在0.2 ～0.5mg/ kg 含毒量的饲料采用0.5 %～0.7 %氨剂量,含毒量0.6 mg/ kg 以上的饲料常用0.7 %～1.0 %的氨剂量,如果密闭时间延长,剂量可相应降低。氨化作用对黄曲霉毒素的降解作用比较显著，但这种方法对其他霉菌毒素的作用效果较差，同时可能因氨在饲料中的残留而影响动物的健康。另外，碱炼法也对其脱毒有效果，但用于饲料脱毒不够方便。2.2 机械脱毒

机械脱毒是指用人工或机械的方法，将谷物和饲料中的发霉颗粒剔除，或通过机械的碾轧除去毒素含量较高的外皮而降低毒素的含量。机械脱毒主要利用霉菌毒素在谷物和饲料中的分布特点而进行，所以该方法能在一定程度上除掉因虫鼠害、破损等霉粒。但由于该方法费时费力，而且效力很低，在现代化大规模饲料生产中很少应用。

2.3 物理脱毒

物理脱毒法主要有吸附法、水洗法、剔除法、脱胚去毒法、溶剂提取法、加热去毒法、辐射法等。物理方法主要是通过在饲料或谷物中添加各种吸附剂，降低霉菌毒素在胃肠道的吸收，即在饲料中添加可以吸附霉菌毒素的物质，使毒素在经过动物肠道时不被动物所吸收，直接排出动物体外。在这其中吸附法是现代饲料中霉菌毒素脱毒最为有效的方法。

2.3.1 活性炭

对毒素有一定的吸附作用，但没有选择性，对某些营养元素及药物也有吸附作用，因此临床效果不佳。

2.3.2 铝硅酸盐类

天然铝硅酸盐,如沸石、蒙脱石、硅藻土、高岭土等,天然铝硅酸盐矿物吸附力小,效率低,占饲料容量大,对营养物质有一定吸附,因而直接用于饲料效果不好。对天然的铝硅酸盐进行改性后可以改善它对霉菌毒素的选择性吸附能力。铝硅酸盐类吸附剂对黄曲霉毒素有良好的吸附能力,并且有不少体内(喂养)试验结果证实了这类吸附剂的实际效,但它们存在对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢菌素等毒素吸附能力不足的问题。不过通过适当的改性有可能使它具有更广泛的吸附能力。这类吸附剂的另一个缺点是,它们表现出了对维生素及矿物盐的非选择性吸附能力。2.3.3 酵母细胞壁提取物

从酵母培养物细胞壁中提取的甘露糖（MOS）,这类新型抗原活性物质,在调整动物肠道微生态区系,在对抗有害微生物的过程中发挥重要作用。MOS 对AFT 的总结合率可达100 % ,具有添加量少,作用显著以及结合的霉菌毒素种类范围广等特点。

酯化的葡甘露聚糖（EGM）是一种新型的霉菌毒素吸附剂，是从酵母细胞中提取出的功能性碳水化合物。EGM有很大的表面区域，1 kg的EGM有相当于2.2万 m2的表面区域。其表面富含不同孔径的孔穴，用以大面积地扑捉不同种类的霉菌毒素。而且酯化葡配甘露聚糖与霉菌毒素结合后，霉菌毒素不易被解离。所以，酯化葡配甘露聚糖对多种霉菌毒素具有较强的吸附作用，而且对饲料中其他营养成分无显著的负作用，同时还可能对动物的其他生理功能有着积极的作用，是一种广谱的，具有很大潜力的霉菌毒素吸附剂。

除上述方法，还有在饲料中添加营养元素，如蛋白质、氨基酸以及硒可提高肝脏的解毒能力，以转化毒素；酶制剂高效地催化、降解AFT 为无毒物质。

二、玉米赤霉烯酮

1、玉米赤霉烯酮基本特性

一种镰孢菌毒素,该毒素主要来源于玉米，湿度22%-25%为其产生适宜条件。熔点161 ℃～163 ℃,不溶于水,溶于碱性溶液、乙醚、苯及甲醇、乙醇等。

ZEN 可由胃肠道持续吸收, 肝肠循环可使ZEN在胃肠道滞留时间延长, ZEN主要随粪便排出, 少量ZEN 可由乳汁排泄。猪摄入Z E A 后，其剂量的67% 在48h内被排出，尿中含45%，粪中含22%。ZEN 在动物体内主要有两条代谢途径，一个是经3α和3β羟基类固醇脱氢酶催化形成α和β-玉米赤霉烯醇(Zearaleno l, ZEL)；另一个途径是与葡萄糖醛酸结合。研究表明，ZEN 在不同动物肝脏转化的主要代谢物不同，猪主要转化为α-玉米赤霉烯醇，而奶牛主要代谢为β-玉米赤霉烯醇。α-玉米赤霉烯醇对大鼠的雌激素活性大约比ZEN 高400%，α-玉米赤霉烯醇对猪子宫内膜的雌激素受体具有较高的亲和力，通过和雌激素竞争目标组织细胞上的受体发挥作用。

2、玉米赤霉烯酮的脱毒

对于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的解脱毒研究主要集中在吸附法和生物降解法上。2.1 物理脱毒法

研究结果表明，消除ZEN 污染最实际、有效的方法是在饲料中添加霉菌毒素吸附剂，在肠道内选择性地吸附ZEN，使其经过消化道排出体外。研究较多的吸附剂主要有硅铝酸盐类和甘露聚糖。其中以硅铝酸盐类吸附剂研究应用最为广泛。

未经修饰的硅铝酸盐类对ZEN的吸附能力不佳，经十六烷基吡啶鎓或十六烷基三甲基铵溴化物等对硅铝酸盐类吸附剂进行化学改性，以增强硅铝酸盐表面的疏水性，从而增加对ZEN的吸附能力。

消胆胺具有显著降低ZEN 肠吸收的作用，尤其是2% 组使ZEN的小肠吸收率由32% 显著降低到16%。经试验证实，消胆胺可以作为一种饲料添加剂防止母猪的雌激素过多症。

研究表明,通过酶解的方法从酵母的细胞壁提取出的葡甘露聚糖可以结合饲料、谷物中大部分的ZEN。胞壁上的β葡聚糖等多糖是细胞壁吸附的主体,疏水作用在其中起着重要作用。热处理或酸处理时,细胞壁多聚糖和肽聚糖的糖苷键或者肽键断裂,使肽聚糖结构变薄而孔径增大,菌体对真菌毒素的吸附能力增加。试验结果表明，酵母细胞壁可以吸附ZEN 2.7 mg/kg，并且这种吸附平衡可以在10 min 内达到。甘露聚糖由酵母细胞内壁提取而得，对ZEN 有一定的吸附作用。Swamy 等进行的体内试验结果表明，甘露聚糖可使猪避免ZEN 造成的生产性能下降。

2.2生物降解

应用微生物生成的特殊酶来分解或使ZEN 变性。此类脱毒法条件温和，可将毒素彻底分解而不会有毒性物质残留，只针对ZEN 起作用而不会破坏饲料和原料中的其他成分。

三、单端孢霉烯族毒素

1、单端孢霉烯族毒素含有特征性的12，13-环氧-单端孢霉-9-烯环结构，根据它们的化学结构的不同，分成4 种类型：目前已经鉴定了超过200 种单端孢霉烯族毒素，但是主要污染食品和饲料的单端孢霉烯族毒素是A（T-2 毒素、HT-2 毒素）、B（脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、雪腐镰刀菌烯醇（NIV））型单端孢霉烯族毒素。

潮湿、温和多雨的气候有利于DON生长。有研究认为9天以上的阴雨天和21℃的平均气温为其生长最适条件。

2、单端孢霉烯族毒素的脱毒

对于DON、T-2等单端孢霉烯族毒素的脱毒研究，物理处理的效果常常不太理想，并且往往会改变营养成分。虽然许多化学处理能显著降低单端孢霉烯族毒素的浓度，但可能会降低食物和饲料中的营养价值，也有可能残留有害物质，这些副作用限制了它们的应用。目前，能有效转化单端孢霉烯族毒素的微生物不多，它们主要来源于动物肠道、土壤、植物等自然环境中。生物方法通过脱环氧化、羰基化、羟基化、水解及葡萄糖苷酸化等反应，在温和的条件下，将单端孢霉烯 族毒素转化成低毒或无毒产物。

2.1 牛瘤胃液中分离得到菌株BBSH 797，主要的作用是在体内和体外将DON 转化成DOM-1。后来证明，菌株BBSH797 也能转化A 型单端孢霉烯族毒素，脱环氧作用，例如将SCP 转化成脱环氧SCP，或者脱乙酰作用，将T-2 毒素转化成HT-2 毒素。后者毒性均明显小于前者。

2.2 从鸡肠道消化物中分离纯化和鉴定了细菌菌株LS100（IDAC180507-1）和SS3，检验了它们对12 种单端孢霉烯族毒素的转化能力。转化的类型与它们的分子结构有关。对无乙酰化的单端孢霉烯族毒素例如DON、NIV 和疣孢霉素，脱环氧代谢物是主要的的转化产物。但是，单乙酰单端孢霉烯族毒素3-ADON，15-ADON 和镰刀菌烯酮X 主要转化成脱乙酰产物。二乙酰单端孢霉烯族毒DAS 和NEO仅表现出脱乙酰作用。T-2 毒素也仅有脱乙酰作用，而HT-2 毒素和T-2 三醇普遍的反应是脱环氧作用。大鼠肠道微生物将T-2 毒素转化成脱环氧产物，脱环氧HT-2，脱环氧T-2 三醇，进一步转化成T-2 四醇和SCP。

除此以外，单端孢霉烯族毒素是谷类农作物中比较常见的真菌毒素，它们具有很强的物理化学稳定性，但是它们在自然环境中并没有蓄积，这表明自然环境中可能存在着DON 生物转化降解作用。土壤、水体等自然环境被作为筛选单端孢霉烯族毒素转化微生物的来源。植物病原物微生物也可通过脱环氧化以及脱乙酰化来降解毒素。

四、赭曲霉毒素

第二篇：食品毒素

台湾塑化剂事件

鉴于台湾有毒起云剂生产链已存在多年。有专家建议，大陆相关部门也应对相关食品进行排查，并对消费者的血液进行抽查调查，以确认危害性及危害范围

《国际先驱导报》记者傅双琪、张勇 特约撰稿郑雯发自台北短短一周内，一种化工业用剂“塑化剂”突然闯入台湾食品业界，并打翻了全台的饮料、保健品市场。

截止本报记者6月1日发稿时，台湾已被发现受塑化剂污染的产品超过500项，其中更有“统一”、“白兰氏”等知名品牌。“这是我30年来看过的最严重食品掺毒事件。”台湾大学食品研究所教授孙璐西说。

意外发现揭露“冰山一角”

最早发现“毒素”的，是一位在食品药物管理局服务近26年的杨姓检验员。她现年52岁，是两个孩子的母亲。今年3月中旬，在抽验益生菌是否违法掺杂减肥西药时，她意外发现检验仪器出现异常讯号。用台卫生署相关官员的话说，“她本来可以装作没看见”，但出于对食品安全的格外关注，这位检验员认真比对数据后，终于如抽丝剥茧般，赫然发现了不应出现在食品当中的塑化剂。这才使台湾卫生部门顺藤摸瓜查出这起“有毒食品案”。

5月23日，台卫生部门通报，发现台湾最大的食品添加剂供应商昱伸香料有限公司在食品添加剂“起云剂”中非法添加可致癌的塑化剂“邻苯二甲酸二酯”(DEHP)。另一家起云剂供应商宾汉香料化学公司也被曝光非法添加另一种塑化剂“邻苯二甲酸二异壬酯”(DINP)。目前，受这两家供应商波及的企业达200多家。

按照台湾法规，“起云剂”为合法食品添加物，通常是由阿拉伯胶、乳化剂、棕榈油及多种食品添加物混合制成，可帮助食品乳化。而不法商贩用化工原料塑化剂替代了起云剂中的棕榈油，以降低成本，提高效果。据孙璐西介绍，DEHP和DINP是普遍用于塑料材料的塑化剂，会危害男性生殖能力，促使女性性早熟。其中，DEHP的毒性比三聚氰胺高20倍。

随着相关部门的调查进展，有毒塑化剂的波及面之大，令岛内外震惊。

继运动饮料、果汁、益生菌粉验出塑化剂后，连蚬锭、山药薏仁谷粉、婴幼儿营养补给品也相继“沦陷”，塑化剂似乎无所不加。由于起云剂本身的功能可使食品油水变得黏稠，看起来更原汁原味，所以现阶段只要是看起来混浊、呈雾状食品，比如台民众钟爱的珍珠奶茶等食品的锭状剂都被合理怀疑添加了有毒的起云剂。

在对昱伸公司的调查中，台方更发现其下游厂商“金果王公司”向台北著名的士林夜市约50多家冰品、冷饮摊商供货。至此，享誉海内外的台北夜市美食，也未能幸免于难。

“我执教生物化学将近30年，自认是此行业专家。我敢保证民众目前看到的、听到的，只是冰山之一角，说不定只是冰山之十分之一角。大家还是回家乖乖吃妈妈煮的东西吧。”台湾清华大学分子医院研究所教授李宽容如是说。

第三篇：霉菌的基因工程技术

霉菌的基因工程技术

课程：食品生物技术 专业： 班级： 学号： 姓名：

完成时间：2011 年5月26日

霉菌的基因工程技术

摘要：霉菌在自然界中分布广泛，与人们的日常生活极为密切。自从弗莱明发现青霉素以来，国内外对霉菌的研究引起众多学者的关注，本文对目前霉菌的应用现状作一综述，并介绍了利用基因工程改良霉菌菌种常用的几种方法。

关键词：霉菌 基因工程 菌种改良 应用

0前言

霉菌是能引起物种霉变的丝状真菌的统称，是真菌的一部分。凡是生长在培养基上呈绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的菌落，都称之为霉菌。霉菌在自然界中分布非常广泛，与人们的日常生活极为密切，用途很多，如用于传统的酿酒、制酱和制作副食品及其他的发酵食品，并可从中提取药物、色素等。总之霉菌在农业、纺织、食品、医药、皮革及促进自然界的物质循环等方面都起着极为重要的作用。当然它对人类也有有害的方面，如可使人、畜、农作物患病，使食品、纺织品霉变等。1霉菌的应用 1.1抗生素

抗生素是微生物在代谢过程中产生的能选择性地抑制其它种微生物生长和活动，甚至杀灭它种微生物的生物活性物质。随着青霉素的发现和由此研制而成的多种抗生素使人类得以治愈传染病、有效地控制传染病的流行。除了青霉素，还有许多抗生素来源于霉菌，例如灰黄霉素、头孢霉素等。1.2 生物农药

自然界中有很多生物合成的天然物质具有农药功能，提取其有效成分加工为农药应用,这是制取生物农药的主要途径。目前包括我国在内的许多国家还大量应用化学农药，已普遍导致了对环境的污染，致使农产品安全卫生问题严重，品种下降，并频繁危及人类身体健康。生物农药有以下几个优点:能有效的控制害虫，不杀伤天敌，不破坏生态平衡，不污染环境，因而有广阔的开发前景。目前从霉菌着手寻找生物农药的研究也很深入广泛，例如：木霉菌是一类具有广谱性、拮抗性生物防治菌。1.3天然色素

食品及化妆品生产领域中都离不开色素，但多使用化学合成色素，其毒性问题已逐步引起人们的关注，国内外在其用量及使用范围方面均有限制。从生物中提取的天然食用色素无毒性，食用安全性好，但大多数因原料来源少，价格高限制了其广泛应

用。目前用霉菌生产色素的例子也很多，例如:红曲霉菌，是用于提取色素最多的霉菌，中国利用红曲已有上千年的历史，用于红腐乳、酒类和其他食品中。1.4抗肿瘤

在霉菌发酵产物中还发现有能抑制缺氧信号传递的小分子物质，很多类型的人类肿瘤细胞都处在严重缺氧的状态下，它们为了生存，建立了一系列的级联反应来缓解缺氧。Pladienolides是一类由普拉特链霉菌 Mer2 11107发酵产生的大环内酯类抗生素，可抑制肿瘤细胞生长和缺氧信号传递，它在小鼠异种皮移植入肿瘤的模型中表现出了强大的抗肿瘤效果。可见它有望成为新型的抗肿瘤药物。1.5具有特殊活性的酶

木霉菌能产生纤维素酶，它可直接作用于纤维素使其断裂分解为低分子的化合物及葡萄糖等被动物所利用，另一方面，纤维素酶可使粗纤维素分解从而可使更多的植物细胞内容物分离出来，提高了这些营养物质的消化率。此外，木霉菌还可产生半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶，这些酶的共同作用可提高对碳水化合物、蛋白质和矿物质的消化吸收率，促进吸收[1]。1.6食品发酵

腐乳是我国独特的传统发酵食品之一，系用豆腐坯经毛霉菌培养酿制而成。毛霉菌种的质量好坏关系到腐乳的形状、色泽滋味及理化质量，目前经过菌种选育，已获得一株生长快速、菌丝旺盛、蛋白酶活性强的毛霉菌株，用它制成的接种剂可用于腐乳和腊八生产，其产品质量优良、稳定[2]。此外，常用于腐乳的霉菌还有黑根霉、米曲霉、红曲霉等[3]。2基因工程

2.1基因工程的涵义

用酶学方法，将异源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需要的生物品种和产物。[4]2.2基因工程操作的主要步骤：

（1）采用cDNA文库人工合成或PCR扩增，分离制取目的基因片段（2）采用核酸限制性内切酶Ⅱ同时剪切目的基因和克隆载体

（3）在T1DNA连接酶的作用下将目的基因与基因载体连接而成重组DNA（4）把重组DNA分子导入受体细胞，并在一起扩增而成克隆子（5）标记分析和筛选出获得重组DNA分子的克隆受体细胞

（6）进一步了扩增、转化、表达，最终生成新的优良性状的菌种或人类所需要的产品

2.3基因工程的工具酶

酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中应用的酶统称为工具酶。要取得所需的目的基因DNA并与载体DNA连接在一起形成DNA重组体，首先要提供限制性内切酶和DNA连接酶。此外，还有其他工具酶，如T1多聚核苷酸激酶、碱性磷酸酯酶、核酸酶S1、反向转录酶和末端脱氧核苷酸转移酶等。到目前为止，常用的工具酶已有3000多种。2.4基因工程的载体

目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体。载体的具备以下几个性能：

（1）分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。

（2）能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。

（3）要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点。（4）有适合的标记，易于选择。

（5）有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。

（6）从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。3霉菌的基因工程改良 3.1目的基因的制备

3.1.1限制酶法 用限制性内切酶消化含有目的基因的外源，使其获得目的基因,并使之产生粘性或平头末端 ,以与载体连接。限制酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型,常用的为Ⅱ型酶 ,因为它有特异性识别位点 ,切口有规律 ,只要有镁离子即可激活,且效率极高。

3.1.2cDNA法 由于真核生物的基因中含有非编码间隔区 ,在原核生物中无法正常表达 ,必须除去内含子。mRNA是经转 录加工过 的RNA,无内含子 ,在反转录酶下,以mRNA为模板合成出互补DNA再加上接头,即可与载体连接。

3.1.3 PCR扩增技术实际是体外DNA合成放大技术。其基本原理是依据细胞分裂中DNA合成半保留机制，及在体外DNA分子于同温度下双链和单链可以互相转变的性质 ,人为控制体外合成系统的温度,使双链变成单链。单链DNA和人工引物退火。以

及在dNTP存在下 ,耐高温的DNA 聚合酶使引物沿单链模板延升双链DNA高温变性,低温退火,适温延升等三步循环使DNA 扩增。

3.1.4鸟枪法 鸟枪法实质上是采用基因工程手段把染色体DNA用限制性内切酶切割，将所有的片段都连接到某种载体上，转入大肠杆菌中增值。再用适当方法来筛选含该基因的重组体菌落，从重组体细菌提取DNA，经酶切后即可制取该基因。对真核细胞基因，因酶切后形成大小不等的成千上万DNA片段，若采用此法则难于筛选出所需要的基因。因此，可采用凝胶电泳、密度梯度离心法或液相层析等方法。先把DNA片段按大小分成几个组，然后，在采用鸟枪法分离目的基因。

3.2选择适当的载体 载体是用于传递外源DNA序列进人宿主细胞,其本身也为DNA分子。

合适的载体有如下要求：必须能 自我复制。有可克隆位点 ,供外源DNA插人。有可供选择的遗传标记 ,如抗药性基因、酶基因、营养缺陷型等。载体应尽量小 ,抗剪切力。表达型载体应具备与宿住基因相应的启动子、增强子、前导序列。常用的载体有：质粒载体、入噬菌体、粘粒、丝状噬菌体、病毒载体、酵母人工染色体卡粒载体。

3.3目的基因的体外重组

目的基因的体外重组即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。重组有如下方法：:粘粒末端法 ,且常用双标记法。平头末端连接法 ,用T4DNA连接法。人工接头法,其大小应为8─12bp。用同聚物接尾法 ,常用cDNA法。

3.3.1粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。

3.3.2人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，采用此方法。首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。

3.3.3人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。3.4重组DNA导入宿主细胞

重组子构建后 ,必须送人宿主细胞使之发挥作用 ,常用物理方法、化学方法和生物方法。其一般过程为：

（1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。3.4.1物理方法

3.4.1.1基因枪法 该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。

3.4.1.2电激法 是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。

3.4.1.3激光微束法，此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。

3.1.4.4超声波法基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。3.4.2化学方法

3.4.2.1PEG法(聚乙二醇)PEG是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连；还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜之间的融合和外源DNA进入原生质体。

3.4.2.2脂质体法

脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。3.4.3生物方法

3.4.3.1转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.4.3.2转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.4.3.3转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 3.5重组DNA的筛选与鉴定

基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。

3.5.1克隆基因表达有三个条件： ⑴ 基因的编码区不能被插入序列中断

⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别 ⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。

3.5.2筛选含重组体的阳性菌落的方法：平板筛选、限制酶切图谱筛选、PCR筛选重组体、原位杂交技术。

3.5.2.1平板筛选

平板筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素的培养平板上生长；未转化的则不能生长。

(1)插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。

(2)蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生α-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。

3.5.2.2原位杂交技术

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

3.5.2.3限制酶切图谱筛选

所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。

4用基因工程获得抗生素高产菌株的实例

青霉素G酞化酶活力的提高[5] 青霉素G酞化酶可把青霉素G转化为 6一APA,它是新合成或半合成青霉素的有用原料 ,在抗生素工业中有着重要作用 ,因大肠杆 菌ATC-CL105菌株可产生青霉素G酞化酶,可将这种酶基因连接于一个多拷贝质粒载体上 ,通过基因测量应提高青霉素G酞化酶活力水平,用装配型质粒克隆系统进行青霉素G酞化酶基因的克隆,ATC-CL105菌株DNA用 ΗindⅢ切开并插人装配型质粒上 ,得到由3000个克隆组成的ATC-CL105的基因文库,克隆带有青霉素G酞化酶基因被生物测试系统选得 ,文库的单菌落涂布于含有青霉素G和一株对6一APA敏感的粘质少母氏菌菌株的软琼脂上,产生青霉G酞化酶的克隆通过对敏感性测试菌抑制 圈来识别 ,筛选文库中的 10000个菌落,获得一个阳性克隆,把亚克隆青霉素G酞化酶基因转移于PBR322质粒上,该质粒在每个细胞中扩增约50个拷贝,但酞化酶只增产6倍,大肠杆菌中PBR322质粒上的克隆青霉素G酞化酶基因在发酵条件下使用相当稳定。

参考文献：

[1]吴裕本,林潘平.某些木霉菌株的产酶高峰及其纤维素酶制剂饲喂兔的试验〔J〕.福建农业大学学报 1994, 23(3)[2]邓芳席,刘素纯.腐乳毛霉菌种选育及产酶条件研究〔J.湖南农学院学报 1995,21(1)[3] 潭周进,喻科,李仲强,等.霉菌腐乳品质的影响因素研究〔J.食品与机械 2002，(2)[4]彭志英主编.食品生物技术导论.北京:中国轻工业出版社，2010，（9）[5]王狱 ,方金瑞 ·抗生素 科学 出版社1988,220-111,

第四篇：毛霉菌感染控制措施

毛霉菌感染控制措施

1、做好人员管理

1.1 工作人员管理

医院及科室高度重视毛霉菌感染管理工作，多次积极组织对医务人员进行感染预防与控制知识教育及培训，以提高医务人员对毛霉菌感染预防和控制的认识，确保医务人员掌握正确有效的预防和控制措施。同时组织科室内护工及保洁人员进行毛霉菌感染控制相关知识教育，以使每一名ICU内工作人员认识到毛霉菌的危害及应对措施，更好地开展毛霉菌感染控制工作。对毛霉菌感染病人固定管床护士，非管床的工作人员尽量减少进出隔离病室。入隔离病室工作人员要求戴口罩、帽子、手套，穿ICU专用鞋，做好消毒隔离工作。

1.2 病人管理

为了切断传播途径，防止毛霉菌在病人、工作人员中扩散，感染病人尽量入住单间病房，将其与非毛霉菌感染病人分开，做好隔离措施，在标准预防基础上实施严密的床旁接触隔离，病人临床症状好转或治愈，连续2次培养结果阴性(每次间隔>24 h)方可解除隔离。对病人积极治疗原发病，增强抵抗力，以减少感染毛霉菌的几率。

1.3 探视人员的管理

探视人员每日在病室外专用探视通道隔玻璃窗探视病人，尽量减少不必要的室内访客探视。入室探视的访客应穿专用的清洁隔离衣，穿鞋套或ICU内专用鞋，戴好口罩，探视时尽量避免接触病人及周围物品，入室探视前和结束探视离开病房时，应洗手或用快速手消毒液擦拭消毒双手。

2、加强环境管理

科室规范病房结构，设立单间为毛霉菌感染病人的隔离病室，病室每日上下午至少各开窗通风1次，病室内使用动态空气消毒机，2 h～4 h定时对房间进行换气及空气消毒，保证空气质量[10]。门窗、物体表面仪器设备表面每日用1 000 mg/L含氯消毒液湿式清洁，保持墙面和门窗无尘，有血迹或体液污染时应立即用1 000 mg/L含氯消毒剂擦拭消毒。病室内地面每日用含氯消毒剂拖地3次或4次，污染时及时清理。病床、床旁桌、床头柜、治疗车等每日用含氯消毒剂擦拭消毒两遍，使用过的抹布、拖布用1 000 mg/L含氯消毒液浸泡2小时以上再清洁晾干。仪器设备专人专用，如呼吸机、血糖仪等固定。公用物品避免进入隔离房间，物品一旦进入此房间，需经过消毒处理(1 000 mg/L含氯消毒剂)后方可拿出。呼吸机、监护仪每日清洗过滤网，用75%乙醇擦拭按钮及表面用含氯制剂擦拭外壳;微量泵、听诊器、血糖仪等每日用75%乙醇擦拭消毒。一次性物品严格一次性使用，用后按感染性医疗废物分类处理。

3、加强医疗护理操作流程管理

3.1 加强接口流程管理

本组7例病人为ICU外带入的毛霉菌感染，经过积极的抢救治疗后3例病人病情好转转出ICU回普通病房。为了防止转运过程导致毛霉菌的传播，制订了特殊感染病人接口流程管理规程，要求收到病人即将转入的通知，接听电话者询问清楚病人目前的基本状况，有无特殊事项(如有无特殊感染，是否需要准备抢救仪器设备等)。本组病人经细菌培养结果为毛霉菌感染后，立即选择单间病房，备好用物，通知管床护士做好迎接准备。病人到达ICU病房后以ICU专用对接车接病人入住隔离病房，对接车上铺一次性床单，使用后取下床单，按感染性医疗废物处理。与病房护士做好病人病情、治疗、护理交接，床头挂隔离标识牌，病历上贴“隔离”字样。病人转出ICU前通知病房做好迎接准备，以ICU专用对接车护送病员回病房，并做好交接。

3.2 加强消毒隔离及无菌技术，严格手卫生

对毛霉菌感染病人，在标准预防的基础上实施接触隔离，同时，因空气中的毛霉菌孢子也可经过吸入导致感染，故应注意呼吸道隔离。在诊疗护理操作过程中严格遵守无菌技术操作规程，特别是行中心静脉置管、气管插管、气管切开、留置尿管等操作时，应当避免污染，减少感染的危险，对留置深静脉导管、留置尿管、气管插管或机械辅助通气者严格按三管感染控制要求处理。医务人员的手卫生是预防和控制医院感染最简单和最有效的环节[11]。要求直接接触病人前后，进行清洁或侵入性操作前，接触病人体液或分泌物后，接触病人使用过的物品后，从病人的污染部位转到清洁部位实施操作时，严格实施手卫生。隔离病室内设有独立的洗手设施，床旁配备快速手消毒液，以增加医务人员洗手的依从性。手上有明显污染时应洗手;无明显污染时可使用快速手消毒液擦手或洗手。进行操作时可戴一次性袖套及手套，以减少手臂及手的污染，完成诊疗护理操作，离开房间前必须及时脱去袖套及手套至黄色垃圾袋中，再洗手或用快速手消毒液进行手消毒。

3.3 合理使用抗菌药物

遵医嘱合理使用抗生素，减少耐药菌的产生。掌握药代动力学知识，自觉按规定时间给药，保证病人的有效血药浓度，以最大限度提高抗生素的使用效果，防止耐药菌的产生[12]。

3.4 加强医疗废物管理

医疗废物严格分类收集，日产日清。处理医疗废物时做好个人防护，防止污液污染操作者和发生锐器伤。针头、刀片等利器放入锐器盒内，注明标记，输液管路、敷料分别放入室内双层医用垃圾袋中，外贴“隔离”标志，以感染性医疗废物送焚烧或无害化处理。

3.5 加强终末处理

严格的终末消毒处理是防止毛霉菌传播最有效的措施之一，有效的终末处理能去除及杀死残留在仪器设备、物体表面、及空气中的毛霉菌，防止毛霉菌的继续传播。实施终末处理人员做好个人防护，戴口罩、帽子、手套、穿隔离衣。拆除病室内床单元布类及窗帘，用双层塑料袋封装，注明名称、数量及“隔离”标志，送洗浆房处理。一次性医疗废物(吸氧管、吸痰管等)及医用垃圾以双层黄色塑料袋封装，外贴“隔离”标志，以感染性医疗废物处理。监护仪、呼吸机等医疗仪器严格消毒处理，呼吸机管道一次性使用，污染管道以感染性医疗废物处理，湿化罐、螺纹管高压灭菌。床单位周围物体表面擦拭消毒，地面以1 000 mg/L含氯制剂清扫;床垫、被褥、枕芯以移动式三氧消毒机消毒30 min以上;关闭门窗、空调及换气扇，以三氧消毒机行病室空气消毒2 h，后通知感染科行终末消毒后细菌学监测，监测内容包括病室内物体表面，医疗仪器表面。地面及空气菌落数量等，监测结果阴性才可收治其他病人。做好监测登记工作

积极留取标本开展毛霉菌监测，以及时发现，早期诊断，采取有效的治疗和感染控制措施。对隔离期间的病人定期进行监测，直至临床症状好转或治愈。建立毛霉菌感染病人登记本，做好记录，内容包括病人姓名、年龄、病案号、诊断、简要病史、临床诊治经过、结果以及感染菌种、药敏试验结果、感染控制措施及结果等

第五篇：食品加工厂霉菌污染及其控制措施

食品加工厂霉菌污染及其控制方法

在食品加工过程中“微污染源”很多，如何防止食品被污染乃是一重要课题。霉菌作为为微污染源中的一种，如果不加以控制势必会影响到食品质保期的长短，那又如何控制霉菌污染食品呢？

杀菌消毒专家周立法先生认为：控制霉菌污染，首先要了解霉菌的生长环境、污染食品的条件。在此基础上，方可以提出合理的防控措施，提高食品卫生质量。

一、霉菌的生长环境

1、生产车间的墙壁，比较潮湿部位容易生长霉菌。

2、加工设备存在冷凝水的管路、机壳等容易生长霉菌，3、空气中所包含的水蒸气，在冷凝、液化时最容易产生霉菌，如车间中温度最低的 部位，含天花板、地面、设备表面、墙面等温度低的部位，4、车间内无法保证正常换气，无法让车间湿度保持在55%情况下时，容易生长霉菌。

5、车间忽冷忽热，容易产生冷凝水的地方，容易遭到霉菌侵害。

6、离墙近的设备、制冷风机容易产生冷凝水，容易产生霉菌。

7、温度相对较低的车间速冻库门，请一直保持关闭状态。如果这些温度较低车间的 门没有关闭的话，那么旁边车间传过来的热空气涌进行，就形成很高的湿度，从而在空 气冷却的时候形成液化，容易生长霉菌。

8、车间的空调系统、净化管道系统等，其自身容易产生霉菌。

二、霉菌的生长习性

与霉菌的生长繁殖关系密切的有水份、温度、基质、通风等条件，为此，只有充分的了解霉菌的生长习性，才能为下一步控制霉菌提供理论依据。

1、水份 霉菌生长繁殖主要条件之一是必须保持一定的水份，当食品中的水分活性值为0.98时，霉菌最易生长繁殖；当水分活性值降为0.93以下时，霉菌繁殖受到抑制，但依然仍能生长；当水分活性值在0.7以下时，霉菌的繁殖受到真正的抑制，可以阻止产毒的霉菌繁殖。

2、温度 温度对霉菌的繁殖及产毒均有重要的影响，不同种类的霉菌其最适温度是不一样的，大多数霉菌繁殖最适宜的温度为25～30℃，在0℃以下或30℃以上，不能产毒或产毒力减弱。如黄曲霉的最低繁殖温度范围是6-8℃，最高繁殖温度是44～46℃，最适生长温度37℃左右。但产毒温度则不一样，略低于生长最适温度，如黄曲霉的最适产毒温度为28-32℃。

3、食品基质 与其它微生物生长繁殖的条件一样，不同的食品基质霉菌生长的情况是不同的，一般而言，营养丰富的食品其霉菌生长的可能性就大，天然基质比人工培养基产毒为好。

三、霉菌污染食品的条件

1、通过包材的污染，如包装或罐装食品的包装袋、包装瓶、瓶盖等，若杀菌不彻底，则其残留的霉菌素则会直接污染食品。

2、空气中霉菌的二次污染，如空气中滋生的霉菌、人员走动时地面扬尘中含有的细菌、空调或新风管道中吹出的细菌等。

3、操作人员自身的二次污染，如手部消毒不彻底、不洁净衣物接触食品等。

4、设备、容器，生产环境的交叉感染，如设备、容器清洗消毒不彻底，不按规定流程定期清洗等、消毒液选用不当或使用剂量不够，生产车间的墙壁天花板的本身的霉菌残留等

四、霉菌的控制措施

1、首先要保持生产车间的内部环境的清洁和卫生，注意对一些卫生死角进行严格 的卫生清理和保持（每半月实施一次深度清洁）：如操作案面的背面，天花板、墙壁、制冷风机的卫生清理，清理卫生后所有的墙壁、天棚、设备、器具、案面表面要用酒精 擦两遍以上，尤其注意清理制冷风机的散热片和冷气的出风口以及内部电机叶片，这是 一个很容易忽视的角落。据泰日得涂料科技有限公司的外聘的专家工程师Mr.hanksen介 绍：若有条件的厂家，建议车间的天花板及墙壁采用泰日得防霉涂料，做好防霉的同时简单 易清洗（高压水枪直接清洗）从环境上防霉抑霉，杜绝环境的霉菌二次污染。

2、对生产车间霉菌有控制，首先必须控制车间的温度和湿度，温度在24度以下，湿度在55％以下，因为过高的温湿度会促进霉菌的生长。

3、在生产时，采用NICOLER动态空气消毒设备对空气消毒,此设备可以在有人的情 况下对生产车间进行消毒，代表性企业为上海康久环保科技有限公司，市场占有率高达 80%。晚上工人下班后采用臭氧或紫外线对空气消毒，防止空气中滋生细菌累加到白天 造成对产品不利，因为一个细菌在24小时内会繁殖成百上千甚至上百万细菌。

4、每天班前、班后对车间内部墙壁、风机、下水道、案面、手部、围裙套袖、预 冷库和库门、速冻库门、包装室、工器具消毒间使用75%的酒精喷洒消毒，班中每2小 时对风机、墙壁、下水道实施75%的酒精喷洒，杀灭霉菌。

5、人员的工作服、更衣室等，必须保持卫生清洁，定期清洗和进行紫外线或臭氧 杀菌30分钟以上，防止人为造成霉菌的交叉污染（不可在有人情况下杀菌）。

6、保证车间风机的正常运转，保证车间内部空气能够达到要求指标，空调的换气 程度好坏直接影响到霉菌的产生。如果车间能保证及时将含有大量水份的空气排出车 间，则极大程度缩小了可能存在霉菌的可能性。据上海康久消毒技术有限公司安全工程 师Mr.hanksen介绍：若有条件的厂家，建议在新回风管道内安装动态杀菌装置，防止 管道内壁、过滤器及空调表冷器滋生细菌，给食品安全形成卫生隐患。