多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究（大全）

第一篇：多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究（大全）

多糖的提取纯化及分析鉴定方法研究

王霄

(合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥230009)

摘要：详细介绍了动植物多糖的常见提取纯化方法的最新研究进展，并比较了各种方法的优缺点。每种方法都有各自的优缺点，在提取时应根据所选材料的性质选用不同的方法，有些方法在一定的条件下可与别的方法协同作用，并对糖的含量测定及分析鉴定方法的研究进展作了概述。

关键词：多糖；提取；纯化；分析鉴定；研究进展 中图分类号：TU 411.01文献标识码：A

Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification Methods

WANG Xiao

(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plantpolysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed.Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions.In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides;extraction;purification;analysis and identification;research progress

菌来源的糖缀合物具有广泛的药理及生物活性

0多糖概述

多糖（polysaccharide）是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个以上的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的单糖组成的多糖称为多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以没的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水，无甜味，不能形成结晶，无还原性和变旋现象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

近年来，国际上对糖及糖复合物的研究己成热点，糖类结构测定和生物活性研究取得了明显的进展。大量实验事实揭示糖类是重要信息分子，参与许多生理和病理过程

[1-2]

[3]。

在对各种中药材化学成分研究的过程中，人

们逐步提高了对植物多糖的关注。植物多糖研究比较深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、银杏叶多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品领域已经取得很好的应用。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景

[4-7]。

1多糖的提取工艺

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最

。到目前为止。己有

300余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水溶性多糖最为重要。已发现有100多种中草药、食药用

终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：提取温度、浸提料液比、提取时间以及提取次数等。为此，研究者对影响多糖提取工艺的这些因素进行了大量研究。林娟[8]

等研究表明水提法提取甘薯多糖的优化工艺条件为：提取温度85℃，加水比1：7，提取时间2.5h，提取率为26．71％。刘永[9]

等研究表明：最佳提取条件为95℃，料液比1：20(g：mL)，提取时间2h，提取3次，茶叶多糖含量为35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取

酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件下分解植物组织，加速有效成分的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的产物。此法可使后续的浓缩和脱蛋白工艺更简易、省时，粗多糖的纯度更高。但会提高生产成本，对提取条件要求较高。杨云

[11]

等人采用的单酶法和复合酶法提取大枣多糖，单酶法提取多糖含量最高可达44.69％，而复合酶法多糖最高含量可达68.13％。1.3超声波提取

超声法是利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高多糖浸出率的，具有快速、安全、简便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破坏等优点，但对提取设备要求较高。李进伟

[12]

等通过响应面

分析法考察超声波功率、提取时间、提取温度、料液比对枣多糖得率与纯度的影响，得出枣多糖最佳的提取工艺条件为：超声波功率86～96W，提取温度45～53℃，提取时间20min，料液比1:20（g:ml），枣多糖得率7.63%，纯度35.57%。与传统的水浴浸提法相比，该方法不仅缩短了提取时间，且提高了枣多糖得率与纯度。1.4微波提取

微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。赵怡红

[13]

等研究表明北冬虫夏草

多糖微波提取最佳条件：微波功率550W、固液比l：30、提取时间30s、提取1次，多糖收率3.67％。刘青梅

[14]

等研究结果表明:对于紫菜多糖

提取微波提取优于热水提取,微波冻融提取效果最佳,提取率最高达7.45%,而热水提取率为2.05%.影响微波浸提的主要因素为浸提时间,其次是微波功率和液固质量比。优选方案为微波功率200W、提取时间8 min、水与紫菜液固质量比40:1。

1.5超临界流体提取

超临界流体提取法根据某些气体在超临界状态下具有特殊的液相性质，对一些组分有较好的溶解性，用来提取目的产物。一般采用CO2超临界萃取多糖组分。朱俊玲

[15]

通过超临界CO2流体

萃取处理芦荟多糖，多糖得率为85.1％，是传统方法的1.5倍。超临界萃取的最佳工艺条件是乙醇用量为250 ml/100g芦荟、萃取压力为25 MPa、萃取温度为35℃。1.6超滤法

超滤是一种膜分离技术。该技术应用于多糖的提取，具有不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点[16]。

1.7酸提法

有些多糖适合用稀酸提取，并且能够得到更高的提取率。如赵宇等

[17]

对海蒿子多糖的提取方

法研究发现，从多糖提取得率来看，酸提法优于传统的水提法。不过此方法只在一些特定的植物多糖提取中占优势，目前报道的并不多。不过在操作上还是应该严格控制酸度，因为在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。1.8碱提法

与酸提法类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不过，也应控制碱的浓度，因为有些多糖在碱性较强时也会发生水解。

2多糖纯化方法

2.1除蛋白

根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）为5∶1 或4∶1，混合物剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种只能除去少量蛋白质，效

率不高，须反复多次，多糖有损失。但此方法比较温和，在避免多糖降解上效果较好，如配合加入一些蛋白质水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷

[18]

研究结果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除

去款冬花多糖中的蛋白最为理想，该法的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶的酶底比为l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再经Sevage法脱蛋白3次，其蛋白脱除率为88.95％，多糖保留率为92.63％。2.2透析法

透析法是利用一定孔目的膜，使无机盐或小分子糖透过，而将大分子的多糖截留下来从而达到纯化多糖的目的。此法的关键是要选择孔目合适的透析膜。纤维膜孔径为2～3nm，可使单糖分子通过，分离效果较好，透析时常需要多次换水，溶液的pH值维持在6.0～6.5范围内。2.3凝胶柱层析法

凝胶柱层析法主要是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的。但溶液流经多孔性凝胶柱时，小分子已扩散人孔中，各溶质依分子量大小顺序依次流出。此方法快速、简单、条件温和。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sephamse)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂。此法还可进行多糖相对分子量的测定。王赫

[19]

采用Sephadex G-100凝胶色谱柱

分离纯化，从龙胆水溶性多糖中分离纯化得到2 种不同的均一多糖组分TP-

1、TP-2。2.4纤维素住层析法

纤维素阴离子交换剂柱层析对多糖的分离是利用pH 6时，酸性多糖能吸附于交换剂上，中性多糖不吸附，用pH相同离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱出来。常用的阴离子交换纤维素有DEAE-纤维素和ECTEOLA纤维素。张兰杰

[20]

等就采用DEAE-纤维素柱分离

北五味子多糖，分别得到了白色结晶和黄色粉末两种多糖产物。

3多糖的分析

3.1含量的测定

测定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe [21]

法、薄层色谱法、酶法、原子吸

收法

[22]、HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法连、续流动分析法检测法

[23]、次亚碘酸盐定量法、蒽

酮-硫酸法（总糖）、DNS法

[24]

（还原法）、磷钼

比色法、邻钾苯胺比色法等。每种方法只对某些多糖的测量效果好。比色法分光光度法离子交换色谱法酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。3.2纯度鉴定

多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HPLC法等。现在应用较多的是HPLC法，旋光度测定[25]

也是纯度

测定的一种方法。3.3分子量的测定

多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法

[26]。

4多糖的鉴定

4.1 多糖一级结构测定

多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目连接方式及苷建构型。常用化学法和仪器分析法。多糖组分与分子比例测定法：部分酸解法、完全酶解法、色谱法；吡喃、呋喃环形式结构的分析：红外光谱；连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序水解、核磁共振； α-β-异头异构体：糖苷酶水解核磁共振；羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith降解法和测硫酸基法（terho法）、核磁共振、质谱法；糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应；多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析。仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法。4.2多糖高级结构测定

目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术，如2D-NMR，13C谱，通用的方法是将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算

[27]

。圆二色

谱法（CD）也可用于糖的构象分析,张丽萍等

[28]

应用谱测定了金顶侧耳多锗的水溶液构象近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活

动的规律已达到前所未有的深度和广度[29]，多糖

作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势

必推动对多糖的认识向深层次发展。多糖的应用展望

我国对多糖的研究起步较晚，但近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现并证实它们具有复杂广泛的生物活性和功能。随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应用领域也将会更加拓宽。然而，由于多糖本身结构比较复杂，种类繁多，其结构测定和分离纯化有很大的难度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关，给多糖的研究和应用带来许多的挑战，这需要相关行业的人士共同应对。

[参考文献]

[1] Benzie, I., and Strain, J.The Ferric Reducing Ability ofPlasma(FRAP)as a Measure of Antioxidant Power.AnalyticalBiochemistry.1996.239:70–76.[2] Wang, C., Sun, Z.Earthworm polysaccharide and its antibacterialfunction on plant-pathogen microbes in vitro.European Journal of

Soil Biology.2007.43:S135-S142.[3] Zhang, Z., et al.(2011).Isolation and antioxidant activities ofpolysaccharides extracted from the shoots of Phyllostachys edulis

(Carr.).Int.J.Biol.Macromol.49(4): 454-457.[4] Li, R., et al.(2009).Extraction, characterization of Astragaluspolysaccharides and its immune modulating activities in rats withgastric cancer.Carbohydrate Polymers 78(4): 738-742.[5] Li, S.-g., et al.(2008).Characterization and anti-tumoractivity of a polysaccharide from Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.Carbohydrate Polymers 73(2): 344-350.[6] Mazumder, et al.(2002).Isolation, chemical investigation and antiviralactivity of polysaccharides from Gracilaria corticata(Gracilariaceae,Rhodophyta).Int.J.Biol.Macromol.31(2002)87-95

[7] Chen, X., et al.(2011).Extraction, purification, characterization andhypoglycemic activity of a polysaccharide isolated from the root ofOphiopogon japonicus.Carbohydrate Polymers 83(2): 749-754.[8] 林娟, 邱宏瑞, 林霄,等.甘薯多糖的提取纯化及成分分析[J].中国粮油学报, 2003, 18(2): 64-66.[9] 刘永, 成战胜.茶叶多糖的提取纯化及其单糖组分的鉴定[J].食品与发酵工业, 2005, 31(6): 134-136.[10] 徐翠莲, 杜林洳, 樊素芳,等.多糖的提取分离纯化及分析鉴定方法

研究[J].河南科学, 2009., 27(12): 1524-1529.[11] 杨云.酶法提取大枣多糖的研究[J].食品科学, 2003,10(24): 93-95.[12] 李伟进, 丁霄麟.超声波提取金丝小枣多糖的工艺研究[J].林产化

学与工业, 2006, 26(3): 73-76.[13] 赵怡红, 邱玉华.微波法与传统工艺提取北冬虫夏草多糖的比较研究[J].内蒙古农业科技, 2009(3): 68-69.[14] 刘青梅, 杨性民, 邓红霞.采用微波技术提取紫菜多糖的工艺研究[J].农业工程学报, 2005, 21(2): 153-156.[15] 朱俊玲.超临界流体萃取芦荟多糖的研究[J].农产品加工,2011(7):67-68.[16] Hanju Sun，Ding Qi，Jiaoyun Xu.Fractionation of polysaccharides

from rapeseed by ultrafiltration: Effect of molecular pore size and operation conditions on the membrane performance.Separation and Purification Technology, 2011,80:670-676.[17] 赵宇, 李志富, 任少红, 等.海蒿子多糖的提取方法研究[J].泰山医学院学报, 2004, 25(5): 429-430.[18] 李婉婷.款冬花多糖提取及分离纯化研究[D].西安: 西北大学硕士学位论文, 2010.[19] 王赫.龙胆多糖的提取纯化及其组成糖分析[J].中国医药指南，2011, 9(21): 250-251.[20] 张兰杰, 张维华, 赵珊红.北五味子果实中多糖的提取纯与化研究

[J].鞍山师范学院学报, 2002, 4(1): 94-96.[21] 李 锋, 唐凤翔, 林海英, 等.耳突麒麟菜多糖的提取分离及表征

[J].福州大学学报, 2003, 31(1): 106-110.[22] 武 云, 张 驰.富硒黑木耳中硒多糖提取分离工艺的优化[J].湖北

农业科学, 2007, 46(5): 821-823.[23] 沈光林, 孔浩辉, 张心颖, 等.流动注射分析仪在烟草分析中的应

用[J].理化检验-化学分册, 2000, 36(11): 490-492.[24]

刘 强, 石丽花, 尹利端, 等.松花粉多糖提取检测方法研究进展

[J].农产品资源, 2007, 35(24): 45-48.[25] 聂凌鸿, 宁正祥.广东淮山水溶性多糖的分离纯化及体外抗氧化活

性的研究

[J].食品科学, 2003, 24(11): 129-133.[26] 刘 荣, 孙 芳, 陈秀丽, 等.松仁多糖化学结构的初步分析[J].林

产化学与工业, 2008, 28(4): 115-117.[27] 来鲁华, 杨显婷.寡糖的构象分析[J].生物化学与生物物理进展,1992, 22(4): 290-294.[28] Reinhold V N, Reinhold B B, Costello C E.Carbohydrate

molecular weigh profiling:sequence, linkage, and brunching

data:Es-CID [J].Anal Chem, 2005，67(1), 1772-1784.[29] Mock K K, Davey M, Cottrell J S.The analysisifunderivatized oligosacchridesby matrix ssisted laser deaorption mass

spectrometry[J].Biochem Biophys Res Comm, 2011, 177(2):

644-651.

第二篇：冬虫夏草产多糖菌株的筛选鉴定及多糖提取

冬虫夏草产多糖菌株的筛选鉴定及多糖提取

摘要：为了得到多糖收率较高的冬虫夏草菌株，从西藏那曲地五高山草甸中采集的新鲜冬虫夏草子实体初步分离得到50株菌株，并对其进行形态观察和18S rDNA-ITS序列分析鉴定，采用超声辅助热水浸提法进行冬虫夏草多糖的提取。结果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性为100%，初步确定为冬虫夏草的无性型，经过超声辅助热水浸提后多糖收率最高为6.619%。

关键词：冬虫夏草；真菌；筛选；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.中图分类号： S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0240-03

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中国传统的名贵中药材，系麦角菌科虫草属真菌寄生于蝙蝠蛾的幼虫所形成的的菌虫复合体[1]。2001年统计，全球冬虫夏草种类已有400种，其中中国记载有105种左右[2]。

冬虫夏草在中国传统医学里已经流传1 300多年，最早记载冬虫夏草的文献始于唐朝前期公元710年的《月王药诊》，记载冬虫夏草能治疗肺部疾病。公元780年《藏本草》记载的冬虫夏草具有润肺、补肾的作用；1765年，赵学敏在《本草纲目拾遗》中记载冬虫夏草的作用是润肺、补肾、益精气，理诸虚百损；1757年，吴仪洛所著《本草从新》中指出冬虫夏草保肺益肾，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草图说》等100多部古书都记载了冬虫夏草名贵药材[3]。

目前，研究证实冬虫夏草有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、抗炎等功效，对肺脏、肾脏、中枢神经系统、免疫系统、心脏、肝脏等均有较好的临床保护作用[4]。由于冬虫夏草的生长环境及人们过于采挖，冬虫夏草已经远远不能满足医疗的需求，人们开始研究冬虫夏草成分与功能的关系，冬虫夏草多糖作为冬虫夏草的重要活性成分，具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬虫夏草多糖在新药开发方面有广阔的前景。

已报道的冬虫夏草的无性型菌株涉及13个属，22个种名[7]，包括细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）、虫草蚧霉属（Lecanicilliuum sp.）、轮枝孢属（Verticillium sp.）、被毛孢属（Hirsutella）、头孢属（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬虫夏草的无性型还有待进一步确定[8]。冬虫夏草的无性型研究已成为研究热点。

本研究分离筛选了50株能够产多糖的菌株，分子生物学鉴定分别为虫草蚧霉属、枝孢菌属、黑粉菌属。超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高为6.619%。研究结果为应用发酵方法生产冬虫夏草多糖替代冬虫夏草应用于医疗，以及进一步确定冬虫夏草多糖的功能奠定基础。材料与方法

1.1 材料

新鲜冬虫夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培养基及试剂

PDA加富培养基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、琼脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蚕蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

种子瓶液体培养基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖9 g/L、麦芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巯基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶异戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 试验方法

1.3.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

无菌条件下将新鲜的冬虫夏草用1%HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗干净，并用无菌的滤纸吸干表面的水分，分离冬虫夏草的蛹体和子座部分，分别研磨成粉，用无菌湿棉签蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培养箱中培养至单菌落出现。挑选菌丝色泽洁白、生长健壮、无杂菌污染的菌株，转接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富试管斜面中，28 ℃培养箱中培养7～10 d，直至整个斜面都长满菌丝，选取生长健壮，无杂菌的菌株即为分离得到的菌株。

1.3.2 菌种的鉴定

1.3.2.1 菌体形态观察

将分离得到的菌株梯度划线接种于PDA平板中，用无菌镊子取无菌盖玻片，斜插入培养基中，每天观察并记录菌落生长情况，7 d后，拔出插片，显微镜下观察菌丝形态及产孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列测定

（1）基因组DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因组DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物为真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。

PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

（3）琼脂糖凝胶电泳及测序。

PCR产物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，用蛋白核酸测定仪测定后无蛋白和核酸残留，送北京宝锐通生物技术有限公司测序。

（4）ITS测序数据分析。

在NCBI中对菌株的ITS序列进行BLAST分析，然后用MEGA5进行系统发育树的构建。

1.3.3 提取冬虫夏草多糖

1.3.3.1 冬虫夏草菌丝体的制备

在无菌条件下挖取1 cm2的分离菌株的培养菌苔接种于装有100 mL种子培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

按10%的接种量，接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

发酵液 8 000 r/min 离心10 min。收菌丝体、80 ℃烘干、粉碎、过80目筛，备用。

将烘干的冬虫夏草菌丝体粉碎，过40目筛，备用。

1.3.3.2 超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖

取干燥恒重的冬虫夏草菌丝粉10 g，提取溶液为去离子水（首次加量料液比为1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%递减）。提取条件：温度90 ℃、提取4次、每次浸提时间90 min，超声功率150 W。

1.3.4 冬虫夏草多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]测定。

1.3.4.1 绘制葡萄糖标准曲线

取烘干至恒重的葡萄糖标准品配置成最终浓度为0.1 mg/mL的标准液，取9支试管分别取葡萄糖标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各补加蒸馏水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min。于40 ℃水浴中加热 30 min，以蒸馏水替代葡萄糖标准液为空白对照，于D490 nm波长处测吸光度。

1.3.4.2 冬虫夏草多糖含量的测定

取冬虫夏草多糖提取滤液，稀释一定的倍数，取1 mL稀释液，加入5%苯酚溶液 1 mL，摇匀、迅速加入5mL浓硫酸，摇匀、静置10 min。于 40 ℃ 水浴中加热30 min，以蒸馏水作空白对照，在D490 nm处测定吸光度。按回归方程计算稀释液多糖含量。按下式计算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待测液中多糖浓度（mg/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）。结果与分析

2.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

对分离出的50株生长健壮、无杂菌、菌丝洁白的菌株进行多糖的提取，并测定多糖含量，根据葡萄糖标准曲线得到的回归方程，计算虫草多糖得率。回归方程为y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根据计算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，达6.619%。不同菌株的多糖含量结果见表1。讨论与结论

冬虫夏草的生活史分为有性型的子囊孢子阶段和无性型的分生孢子阶段。而人工培养、液体发酵菌丝体的冬虫夏草均为无性型阶段，因此，冬虫夏草无性型及菌种的鉴定至关重要。

最早人们判定冬虫夏草有性型和无性型的关系，依据假定无性型与虫草有性型子实体有相关性，用人工诱导虫草子实体的形成。人工诱导方法在人工诱发子实体长出子囊孢子非常困难，培养出的虫草子实体寥寥无几，人工诱导方法只能为虫草有性型和无性型的鉴定提供依据。

刘作易等从云南收集的新鲜冬虫夏草（Cordyceps sinensis），利用微循环对其子囊孢子的产孢结构进行了观察，并与组织和子囊孢子分离的菌株的产孢结构进行比对，还与中国被毛孢（Hirsutella sinensis）的产孢结构进行比较。结果显示微循环的产孢结构与分离菌株和中国被毛孢的产孢结构相似，由此确定冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[13]。该方法虽操作简单，但必须要先明确此菌株的种属关系，该方法在冬虫夏草无性型的鉴定上也还是一种辅助手段。

随着分子生物学的发展，RAPD-PCR技术为确定虫草的无性型提供了可靠的分子生物学证据，但该方法不能很好地确定菌株的种和亚种。ITS序列分析的发展，为菌株无性型与有性型关系及菌株的近缘关系方面提供了可靠证据。Kang等报道，甘肃虫草和冬虫夏草具有相同的 ITS序列，并认为甘肃虫草可能是冬虫夏草的分类异名[14]。张泽文对古尼拟青霉菌种的完整的 rDNA的ITS 区进行序列测定并进行比对，结果表明，分离到菌种为古尼虫草的无性型，即古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究从采摘的新鲜冬虫夏草子实体中分离得到CC-3菌株，运用插片法对该菌株的菌丝形态和孢子结构进行显微观察，初步判断菌株的菌属关系，通过RAPD-PCR技术，用通用引物ITS1 和ITS4扩增出18S rDNA片段，进行序列比对，最后确定该菌株的种属关系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉过程中会损失大量多糖；酶解法提取多糖，条件温和、质量好，但是经济价值高；热水浸提法提取多糖，方法简单易行，但效率较低。超声波产生的强烈振动和空化效应，使细胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本试验采取超声波辅助热水浸提法提取虫草多糖。

多糖测定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法测定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖与蒽酮试剂的显色深度不同，糖混合时，常因不同糖类比例造成一定的误差。而苯酚-硫酸法测定多糖，方法简单、灵敏度高、不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定。

从西藏新鲜的冬虫夏草中初步分离得到50株菌株，经过多糖含量测定，CC-3菌株多糖得率最高，为6.619%，多糖含量高达6.619 mg/g。对CC-3菌株进行形态学观察、分子生物学18S rDNA序列分析，初步鉴定CC-3菌株为Cladosporium sp.菌株。

参考文献：

[1]于洪飞.冬虫夏草无性型鉴定的几种方法[J].安徽农业科学学报，2006，34（12）：2763-2787.[2]Kirk P M，Cannon P F，David J C，et al.Ainsworth & Bisbys：dictionary of the fungi[M].9th ed.Wallingford，UK：CAB International，2001.[3]郭文场，刘 颖，冯贺林，等.冬虫夏草的研究[J].特产研究，1981（4）：1-5.[4]Paterson R R.Cordyceps：a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J].Phytochemistry，2008，69（7）：1469-1495.[5]Qiao D L，Luo J G，Ke C L.Immunostimulatory activity of the polysaccharide from Hyriopsis cumingii[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47：657-680.[6]任 健，张倩落，郑 丽.人工虫草多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响[J].第四军医大学学报，2007，28（21）：1967-1969.[7]Schildkraut J J.The catecholamine hypthesis of affective disorders：a review of supporting evidence[J].Am J Psychiatry，1965，12：509-522.[8]李春如.35种虫草及其无性型鉴定、活性筛选和细脚拟青霉提取物的抗抑郁作用及相关机制[D].合肥：安徽医科大学，2006.[9]马 明，杨克强，郭启荣.改良CTAB 法提取林木树种基因组DNA的研究[J].生物技术，2007，17（3）：36-37.[10]王洪凯，张天宇，张 猛.应用5.8S rDNA 及ITS区序列分析链格孢种级分类[J].菌物系统，2001，20（2）：168-173..[11]宁慧青.不同食用菌多糖含量的比较研究[J].山西化工，2007（3）：44-45.[12]荆留萍，杜双田，金凌云，等.8 种物质对蛹虫草液体发酵中虫草素及多糖含量的影响[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（11）：156-160.[13]刘作易，梁宗琦，刘爱英.冬虫夏草子囊孢子萌发及其无性型观察[J].贵州农业科学，2003，31（1）：3-5.[14]Kang J C，Liang Z Q，Liu A Y，et al.Molecular evidence of polymorphism in cordyceps based on 5.8S rDNA and ITS sequences[J].Mycosystema，2000，19（4）：492-497.[15]张泽文，傅 岚，陈作红.古尼虫草无性型的分子鉴别[J].菌物学报，2005，24（3）：344-348.

第三篇：菠萝蛋白酶纯化方法总结

菠萝蛋白酶的提取方法：

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法

（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。

③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。

离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型

用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡

将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速 通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样

略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱

加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。

二．蛋白含量测定方法

采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。

酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。

菠萝蛋白酶活性的单位定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下（PH7.0 ,37加减1摄氏度）酶作用于干酪素底物1min产生1ug酪氨酸所需酶量。

第四篇：财务分析方法研究

财务分析方法研究

选题的背景及意义

财务分析是财务管理的基础工作之一。财务报表分析是以企业的各项基本活动为对象、以财务报表为主要信息来源、从报表中获取符合报表使用者分析目的的信息，以分析和综合为主要方法，系统认识企业活动的特点，从而评价其业绩，发现其问题，目的是了解过去、评价现在和预测未来，以帮助报表使用者改善决策。

研究的价值

挖掘运营过程中存在的关键问题，需求解决措施，监督反馈落实情况，以支持更好的业绩表现。目的是获得更大的市场份额、更佳的品牌美誉度、更合理的利润，最终更好的满足股东的要求。

论文的框架与结构

第一章导论。本章主要阐述论文选题的背景、研究的目的和现实意义。

第二章财务报表分析方法的介绍。

第三章以四川长虹、深康佳财务状况分析为案例详细阐述

第六章总结与探讨。

第五篇：万能保险持续奖金准备金提取方法分析

寿险精算

精算通讯第六卷第一期

万能保险持续奖金准备金提取方法分析与比较

赵晓京 梁永华

安永华明会计师事务所

【摘要】万能保险持续奖金是保险公司对持续有效的保单或持续交费的保单在满足合同约定条件时给予的奖金。由于保监会未明确规定万能保险持续奖金准备金的评估方法，目前各保险公司的具体做法不一。本文对持续奖金准备金的评估方法进行了研究，并结合公司自身的经验，对市场上各保险公司采用的主要评估方法进行分析和比较。

【关键词】万能保险 持续奖金 准备金方法

一、引言

我国寿险市场上销售的三大类投资型产品：投连、分红、万能保险中，万能保险出现的最晚，但却是2006年保险市场上风头最劲的产品。与其他两类产品相比，万能保险的保证利率与分红保险产品相当，而投连产品无保证利率；万能保险投资账户的结算频率为每月一次，虽然低于投连产品每周一次的结算频率，但明显高于分红保险，因而能及时反映市场投资收益率的变化情况。正是由于万能保险兼具保证利率高、结算频率快的优点，自2004年10月29日中国人民银行宣布上调人民币基准利率后，万能保险就受到了保险公司和消费者的追捧。各公司纷纷推出形态各异的万能险产品，许多保险公司万能保险的保费收入都占到个银渠道保费收入的50%以上，最高达到80%以上。

由于万能保险保证的最低结算利率仍然受到保监会2.5%的最高定价利率的限制，为了提高产品竞争力，许多公司都在产品条款中加入了额外的持续奖金。主要形态有以下两种:

1、持续交费奖励，适用于期交的万能险产品，目的是鼓励投保人交纳续期保费。由于万能保险与传统寿险不同，只要保单的账户价值能满足保单管理费和风险管理费等要求，即使投保人停止交纳保险费，保单仍然有效。为了鼓励客户如期交纳保险-24寿险精算

精算通讯第六卷第一期

之间。也有公司以最低保证利率为折现利率。

（2）账户结算利率的确定。对应于折现利率，各公司一般以保险公司预计投资回报率减去预计利差来确定未来的账户结算利率。目前的《万能保险精算规定》取消了对预计利差不超过2%的规定。

（3）持续奖金是否应该视为账户外的现金流？一种观点是保险公司兑现持续奖金时用于增加保单账户价值但并没有支付给客户，所以持续奖金不应该在持续奖金给付时刻视为账户外的现金流，而应包含在保险公司将来对客户的给付或理赔中；另一种观点是持续奖金相当于保险公司将股东的利益转移给客户，所以在保险公司兑现持续奖金时就视为现金流支出。容易看出，前一种观点下的准备金比后面一种低。

由于万能保险的投资账户也是独立账户，与投连产品有类似之处，而且保监会未作明确规定，所以不少公司都采用了这种方法。

流按照精算模型预测，再将现金流的现值作为一种准备金，用来和当前账户价值比较，差额即为非账户准备金，其中也包括了持续奖金准备金。账户预测和折现率的假设通常为最低保证利率，为保守起见，该方法往往会忽略退保的假设。

三、万能保险持续奖金准备金的方法比较

下面以一款万能型两全保险为例，按以上四种方法评估各保单的持续奖金准备金。

险种：十年期趸交两全保险（万能型）最低结算利率： 2.0% 实际投资回报率假设：5.0% 实际利差假设：1.5%

实际结算利率假设：5%-1.5%=3.5% 保单管理费假设：0.5%

初始账户价值：人民币10,000元

持续奖金为从第六保单起每年账户价值的2%

不考虑死亡率和费用率（方法三假设营业费用等于保单管理费），下表为各方法提取的实际持续奖金准备金的走势图。

4、贴现预测现金流和当前账户价值进行比较 该方法类似于毛保费评估方法，把将来账户价值和非账户价值(如持续奖金和死亡给付等)的现金

各方法持续奖金准备金走势方法一方法二方法三方法四1,4001,2001,***-1