骨髓间充质干细胞在脑损伤中的临床应用

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第一篇:骨髓间充质干细胞在脑损伤中的临床应用

骨髓间充质干细胞在脑损伤中的临床应用

【摘要】 目的 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中区别于造血干细胞的一种多潜能干细胞,可作为多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体。近年研究发现其可在中枢神经系统内存活并能分化为神经样细胞,在体外也可通过定向诱导向神经细胞转化,提示骨髓间充质干细胞有可能取代神经干细胞用于中枢神经系统疾病的细胞治疗和损伤的修复。由于其取材容易,能在体外迅速培养扩增,通过自体移植可避开免疫排斥反应,且能以多种途径包括静脉注射、脑内不同部位进行细胞移植,所以骨髓间充质干细胞在中枢神经系统损伤修复中的临床应用前景广阔。关键词 骨髓间充质干细胞 中枢神经系统 诱导分化 细胞移植

长期以来中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的损伤与再生一直是困扰人类健康的难题,也是科学家们致力于研究的焦点。曾经认为人脑内的神经细胞缺乏再生能力,如果遇到损伤,受损的神经细胞将会永远丧失,由胶质细胞充填。19世纪末至20世纪初,人们逐渐发现低等脊椎动物和两栖类的中枢和外周神经损伤后都能再生,而在哺乳动物中,断定只有外周神经系统(Peripheral nervous sysˉtem,PNS)损伤后可以再生,CNS则没有再生能力。然而随着近十余年对神经干细胞研究的逐步深入,这一传统认识现已被彻底打破。

神经干细胞(Nerual stem cells,NSCs)的发现是在研究造血发生和神经发育的基础上开始的,于20世纪90年代初,Reynolds等 [1] 从成年小鼠脑纹状体分离出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群,参照造血系统干细胞的性质,正式提出了NSCs的概念,它是一类多能干细胞,能长期自我更新(复制),并具有分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的多潜能特性。Gage [2] 于2000年在《Science》上发表文章指出,神经干细胞通常具有:来源于神经系统能产生神经组织;有自我更新能力;能通过不对称细胞分裂产生除自我子代(仍为干细胞)以外的其他类型的细胞(前体细胞))。通过大量试验研究,目有NSCs的生物学特性可概括为:(1)能产生神经组织或起源于神经系统;(2)有增殖能力;(3)在整个生命过程中能自我维持、自我更新;(4)能通过扩增祖细胞而产生大量的后代;(5)具有向多细胞系分化的能力;

(6)损伤或疾病能刺激干细胞分化。以往对于神经系统疾病的移植治疗,主要用胚胎神经干细胞治疗Parkinson病、缺血性疾病等,其不足包括组织来源缺乏、伦理学问题及免疫排斥等多方面问题。为避开胚胎来源NSCs的局限性,近年成人骨髓间质干细胞向神经细胞的分化及在神经修复中的作用,因其独有的优势,已成为NSCs的研究热点。历史回顾及研究意义

130年前,德国病理学家Cohnheim在研究伤口修复时,就提出骨髓中可能存在非造血组织的干细胞。直到20世纪70年代中期,Friedenstein等才首次报道,骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落 [3]。后来的研究表明Friedenstein粗糙分离所得到的细胞是多能的,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。因此,骨髓基

质中的这种多能细胞,由于能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞,而被称为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)。1998年Azizi等 [4] 将人类的骨髓基质细胞植入鼠的纹状体,发现大约20%的植入细胞发生迁移。移植细胞的迁移路径与已知的神经干细胞及星形胶质细胞的迁移路径相同,即从脑室下带沿着白质束迁移到皮层、纹状体、前脑和小脑等部位,未发现炎症和免疫反应,从而证明MSCs可用作自体移植治疗中枢神经系统疾病的细胞和基因治疗的载体。2000年Woodbury等的研究结果显示成年鼠和人的BMSCs能够分化为神经元 [5]。人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)能够分化为神经元样和神经胶质样细胞,其取材容易,体外可迅速培养、扩增,弥补了神经干细胞的诸多缺点,自体MSCs移植又避免了移植后的免疫排斥反应,因此BMSCs作为神经细胞的另一来源,用于神经系统损伤修复的细胞治疗,具有明显的临床应用价值。骨髓间充质干细胞的研究方法

2.1 骨髓间充质干细胞的分离 Friedenstein首先通过贴壁培养的方法分离得到MSCs,他们将全骨髓组织用塑料培养皿培养4h后弃末贴壁细胞,贴壁细胞外观呈多样性,经过2~4天的休眠期后迅速增殖,培养数代后形态趋于一致,呈纺锤形。目前多数实验室分离MSCs是基于此方法。新鲜骨髓内,造血干细胞所占比例较大,造血干细胞较难培养扩增,而非造血干细胞则易于分离扩增。原代培养2~3周后,大多数造血干细胞死亡,剩下的即为MSCs。Colter [6] 报道,MSCs在原代培养以低密度种植可形成单细胞克隆,并增殖迅速。细胞经过5天迟滞期,5天对数生长期后,进入静止期。高密度种植生长缓慢的原因与细胞间相互接触抑制或细胞分泌的因子作用有关。

2.2 骨髓间充质干细胞的诱导分化 MSCs在体外培养时,保持干细胞的特性自身不断地增殖,在不同诱导条件下能够向不同谱系分化。体外诱导神经细胞分化的试剂有:维甲酸(RA)、生长因子、抗氧化剂、脱甲基试剂、可增加细胞内cAMP的混合物和生理学上的神经诱导剂及头蛋白(noggin)等。已有许多实验室在体外条件下利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、维甲酸(RA)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、甲状腺素3(T 3)、胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)等作为增殖及分化诱导因子,对MSCs进行增殖培养,分化诱导,并通过免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果证实MSCs在一定的培养条件下可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。将进行标记的MSCs及诱导后的神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞移植入脑损伤后功能缺失的动物模型上,已取得明显的治疗效果。

2.3 干细胞的鉴定 骨髓间质来源的MSCs,形态成纤维样,可聚集成均匀的集落,流式细胞术分析表明分离的细胞群体表型单一,细胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等呈阳性,但CD14、CD34和CD45造血谱系标记则呈阴性。体外由BMSC分化成的神经细胞很少表现出典型的成熟神经元或神经胶质细胞的形态,而应用免疫细胞化学技术可更准确、方便地鉴定各类培养细胞。可用于鉴定神经干细胞的特异性分子标志物有巢蛋白(nestin)、波形蛋白(vimentin)和musashil蛋白;鉴定神经元的标志物有神经元特异性烯醇

化酶(NSE)、神经特异性核蛋白(NeuN)、中间神经丝(NF-m)、tau蛋白和一些微管蛋白(tubulin-β、MAP-

2、TuJ-1);常用于鉴定星形胶质细胞的标志物是胶质纤维酸性蛋白(GFAP);鉴定少突胶质细胞的标志物有半乳糖苷酶(GalC)和碳酸苷酶Ⅱ(CAⅡ)。骨髓间充质干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究现状

3.1 BMSCs移植 骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化增殖潜能,已有研究表明,骨髓细胞是某些脑细胞如小胶质神经细胞和星形胶质细胞的前体细胞 [7]。Chopp等 [8] 多次将BMSCs应用于脑外伤或脑缺血动物模型,发现hBMSCs约1%分化为神经元,5%~8%分化为神经胶质细胞,并明显促进神经功能恢复。Schwarz等 [9] 应用逆转录病毒携带酪氨酸羟化酶和鸟苷三磷酸水解酶Ⅰ,转染给大鼠和人骨髓间充质细胞,并将细胞移植到大鼠帕金森模型的纹状体,观察到细胞在移植的脑组织中存活至少87天,外源性基因能够表达的时间达9天。Chen [10] 将BMSCs和BDˉNF(脑源性神经生长因子)共同植入大鼠缺血模型的脑缺血边缘,在包括运动、感觉、反射和旋转的神经功能评分中,接受移植的小鼠功能明显改善。Chopp [11] 将MSCs植入脊髓损伤模型1周后的大鼠,发现在脊髓中有移植细胞表达神经蛋白标志,并有功能恢复。Mahmood [7,12] 将MSCs或全骨髓直接或经静脉途径植入大鼠创伤模型,14天或28天后神经功能明显改善,组织学检查移植细胞有小部分表达NeuN、GFAP。

上述用于临床前的动物实验结果表明,MSCs移植无论是局部或静脉途径都能产生积极的治疗作用。近年来,人们不断地探索利用hBMSCs进行细胞治疗和基因治疗。只需通过局部麻醉,就可较容易地得到少量骨髓抽取物,而不影响人体的健康;而且将分离的hBMSCs在体外培养扩增和导入外源基因也相对方便。因此,hBMSCs在将来实际应用时就具有潜在的优势。首先,可以用体外培养扩增的MSCs,作为细胞移植的种子细胞,修复损伤的脑组织。前述的动物实验中已提及用体外培养扩增的MSCs来修复各种损伤,并且具有良好的效果。MSCs在体外培养过程中,可以保持未分化表型不断增殖,达到所需的数目,然后经诱导可定向分化为神经元样细胞等;而已分化的细胞来源有限,在体外培养时,增殖速度较慢,而且还存在去分化的问题。另外,MSCs可以很方便地通过抽取骨髓来得到,而不必通过手术从病人身上得到自身成熟细胞,避免了对病人 造成不必要的二次创伤。其次,可通过转基因的方法,将外源基因导入MSCs。可以将利于定向分化的生长因子基因转入MSCs,促进定向分化,加快体内神经组织修复的进程。然而在MSCs安全有效地用于临床之前,显然需要解决大量有关的MSCs的基础问题,比如组织相容性、优化定向分化

第二篇:骨髓间充质干细胞向视网膜光感受器样细胞诱导分化探讨

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骨髓间充质干细胞向视网膜光感受器样细胞诱导分化探讨

作者:陈金国 徐国兴 白 月 徐 巍 郭 健

来源:《海峡科学》2010年第05期

[摘要] 目的:探讨体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)诱导分化成视网膜光感受器样细胞的能力。方法:用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,利用光感受器细胞培养上清液诱导MSC细胞14 d。用免疫细胞化学染色和Rt-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:诱导细胞14d后即可见有神经元样细胞出现,实验组MSC的Rhodopsin表达率为35.1%±6.2 %,而对照组中无Rhodopsin阳性的细胞, 实验组MSC的NSE表达率为33.6%±4.0 %,对照组为10.6%±5.0%, 实验组MSC的GFAP表达率为9.6%±1.5 %,对照组为13.7%±3.0 %。RT-PCR鉴定结果分析示实验组MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达,而对照组的只表达GFAP和NSE,未见Rhodopsin条带。结论:体外培养的rMSC,经过视网膜光感受器细胞培养上清液导,可以分化为视网膜光感受器样细胞。

[关键词] 骨髓间充质干细胞 光感受器细胞 诱导分化

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),是一群具有多向分化潜能的均质性成体干细胞,它具有两项干细胞最显著的生物学特性:自我更新(self-renewa1)能力及多向分化潜能。1968年, Friedenstein[1]等学者首先报告骨髓中存在一种细胞具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,他们认为这种细胞可能是间充质细胞的前体。随着研究的发现,MSC具有向中内外胚层组织细胞分化的能力 ,可以在体外被诱导分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、肝细胞、上皮细胞、神经细胞等[2, 3]。近年来,BMSCs向神经元细胞的分化的研究成为了研究的热点。可利用抗氧化剂、生长因子、维甲酸、共培养等将骨髓间充质干细胞诱导成神经样细胞[4-6]。本文探索了利用视网膜光感受器培养上清液体外诱导BMSCs分化为视网膜光感受器样细胞的可行性。材料和方法

1.1 材料

清洁级健康Sprague-Dawley(SD)大鼠20只40眼,重量100~125g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司; DMEM培养基(美国Hyclone公司),Neurobasal培养基(美国

Invitrogen公司),B27(美国Invitrogen公司),胎牛血清(美国Hyclone公司),0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司),木瓜蛋白酶(美国sigma公司),多聚赖酸(美国sigma公司),小鼠抗大鼠单CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE,以及相应同型对照单抗小鼠IgG1-

FITC, IgG1-PE和IgG2a –PE(Beckman-Coulter公司),神经元特异性标志小鼠抗大鼠醇化酶(美国 Fisher Scientific公司),光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)(RET-P1,美国Millipore公司),星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)(美国 Fisher Scientific公司),DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司),总抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司),THERMO FORMA 3111 CO2培养箱(美国),OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜(日本),OLYMPUS BH-2型光学显微镜(日本),Beckman-Coulter Epics XL 流式细胞仪(美国),台式高速冷冻离心机(上海),Gene Amp 9700型PCR 扩增仪(美国),Bio-Rad凝胶成像分析系统(Gel DOC2000)(美国),AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台(苏州)。

1.2 方法

1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

取清洁级SD大鼠,4mL/kg水合氯醛(100g/L)进行腹腔麻醉。碘伏消毒,无菌条件下取出大鼠的双侧胫骨和股骨,分别剪断股骨干和胫骨中间及两端的干骺剪断,用含有肝素的培养液10mL进行反复冲洗骨髓腔,冲洗液经200目不锈钢标准筛网过滤组织块以及已凝血块后,进行离心后用20%FBS的DMEM培养基制成单细胞悬液接种于25cm2 培养瓶中,24h后首次换液去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次,换液前PBS洗去部分未贴壁细胞,当70%~80%细胞达到融合时用0.25%胰蛋自酶消化传代,进行扩增培养。用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表达[7]。

1.2.2视网膜光感受器细胞的分离培养和鉴定

在暗环境下无菌取下清洁级SD大鼠的眼球,游离出完整的视网膜神经上皮层。利用木瓜蛋白酶进行消化分离出光感受器细胞,用Neurobasal培养基A 1mL(加入1:50的B27和

0.5mM L-glutamine)进行避光培养,两天换液一次,将视网膜光感受器细胞培养换液的上清液收集于干净玻璃瓶中,通过0.22um过滤筛过滤后按2:3比例与DMEM培养液混合后备用。分别把消化前和消化后的视网膜片进行HE染色,在显微镜下观察,同时对分离的光感受器细胞进行免疫细胞化学鉴定。

1.2.3对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导以及鉴定

将3代的rMSCs接种在6孔板中。分为2个对照组,4个实验组。实验组加入光感受器细胞上清液与10%FBS的DMEM培养基(2:3)进行诱导,对照组用Neurobasal培养基A与10%FBS的DMEM培养基(2:3)进行培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长及分化情况,诱导后14天,行免疫细胞化学和Rt-PCR鉴定,免疫细胞化学:PBS洗涤3次,多聚甲醛固定,0.2%Triton-X作用10 min,过氧化酶阻断,非免疫动物血清孵育 10 min,加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200),GFAP(1:100)抗

体,4℃过夜,加入生物素标记的第二抗体,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液,DAB溶液显色,苏木素复染,中性树胶封固,在显微镜下观察。RT—PCR法检测实验组和对照当中的GFAP,NSE,Rhodopsin的表达。Rhodopsin引物上游引物

ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’,下游引物5’ CGTTGTCCTCA

GCCGATG 3’,扩增长度为107bp;NSE引物上游引物:5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’,下游引物5’ GGGAGATAGC

GGTGTAAC 3’,扩增长度为156bp;GFAP引物上游引物:

5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’,下游引物5’GCAACC

AGGAATAGACCTTCACAA 3’,扩增长度为482bp;内参Rat GAPDH 为

5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’,BC050110为5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’,扩增长度为595bp。参照TRIZOL试剂说明书对诱导的MSC分别提取总RNA,进行反转录、PCR扩增,将 PCR产物电泳后进行图像分析仪采集图像。

统计学处理:采用SPSS13.0统计软件包(statistical package for the social science)分析,采用t检验。结果

2.1骨髓间充质干细胞的鉴定

培养的大鼠的BMSCs接种后24小时开始贴壁,前3天细胞增殖慢,数量比较少,第3开始细胞的增长速度明显增加,7天后就达到融合状态,呈现漩涡状、菊花状。第三代时,细胞仍呈梭形,生长旺盛。BMSCs标志鉴定结果表明,培养的第三代BMSCs干细胞表面标志CD90阳性(CD90+/CD34-:92%),基质细胞表面标志CD44阳性(CD44+/CD34-:93%)(见图1)。

图1 大鼠MSC流式细胞仪检测结果(A: CD90+/CD34-:92%;B: CD44+/CD34-:93%)

2.2 视网膜光感受器细胞的鉴定

取下来的视网膜在消化前后分别进行HE染色,消化前可以很清楚地观察到九层细胞,说明取下来的是完整的视网膜神经上皮层,不含有色素上皮,消化后的视网膜片,光感受器层的细胞变少,其它层细胞完整,光感受器细胞的免疫细胞化学示,光感受器细胞的特异标志物视紫红质的表达率达95%以上。

2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的诱导

实验组BMSCs诱导后的第4天细胞形态开始变化,可见小的突起。随后细胞便圆,突起增长,出现少量神经样细胞的形态,到14天最为明显,出现一、二级分支,相互之间连接呈网状。对照组也有少量的细胞呈神经样的形态。诱导后的神经元样细胞GFAP,NSE,Rhodopsin呈强阳性。非神经元样细胞呈多边形或梭形,上述抗体染色呈弱阳性。阴性对照未见染色。

免疫细胞化学鉴定,共培养2周后,阳性细胞计数结果显示: rMSC的Rhodopsin表达率实验组为35.1%±6.2 %(图2A),而对照组中无Rhodopsin阳性的细胞(图2B),rMSC的NSE表达率实验组为33.6%±4.0 %(图3A),对照组为10.6%±5.0%(图3B), rMSC的GFAP实验组的表达率为9.6%±1.5 %(图4A),对照组为:13.7%±3.0 %(图4B); 对照组与实验组进行两样本的t检验NSE:F =0.09,方差齐,P < 0.001,有统计学意义,GFAP:F =1.726,方差齐,P >0.05,无统计学意义。

A:实验组大量表达Rhodopsin(×100);B:对照组未表达Rhodopsin(×100)

图2 免疫细胞化学rMSCs表达Rhodopsin结果

A:实验组大量表达NSE(×100);B:对照组少量表达NSE(×100)

图3 免疫细胞化学rMSCs表达NSE结果

A:实验组表达有GFAP(×100);B:对照组表达有GFAP(×100)

图4 免疫细胞化学rMSCs表达GFAP结果

RT-PCR鉴定结果分析显示,实验组MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表达,其中GFAP表达比较弱;而对照组的只表达GFAP和NSE,且均较弱,未见Rhodopsin条带(图5)。A:为实验组,GFAP、NSE、Rhodopsin均有表达;B:为对照组,只表达GFAP和NSE。图5 Rt-PCR检测GFAP、NSE、Rhodopsin讨论

本实验模拟视网膜体内发育的微环境诱导骨髓间充质干细胞成为视网膜细胞,利视网膜光感受器细胞培养上清液对骨髓间充质干细胞进行向视网膜样细胞诱导。本实验关于视紫红质的检测,实验组表达率高达35.1 %±6.2 %,对照组没有表达,说明其光感受器条件培养基能使MSC向光感受器细胞方向转化。从而验证了大鼠MSC确实可以在体外被诱导为表达视紫红质的光感受器样细胞,Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或与视网膜片共培养,均未发现表达Rhodopsin的证据。Anthony等[5]对BMSCs向视网膜光感受器细胞诱导分化进行了体内外实验。利用维甲酸、牛磺酸和EGF体外将小鼠 BMSCs成功诱导为视网膜光

感受器样细胞,诱导后的细胞可以表达视网膜光感受器细胞特异性标志物:视紫红质、视蛋白和恢复蛋白,最近国内学者单纯用EGF也可以诱导rMSC表达Rhodopsin[9]。本实验当中NSE表达率也明显高于对照组,而GFAP,两组表达并无差异,说明,光感受器条件培养基促进rMSC向神经元细胞方向分化,而对于胶质细胞方向分化并无诱导作用。本实验的对照并未加诱剂的rMSC也能表达神经元特异性标志,Tomita M[8] 研究说明没有生长因子诱导的MSC没有向神经方向分的证据,强调生长因子在神经分化中的重要地位,但是也有许多学者提出了在未诱的条件下仍发现神经特异性标志物的表达,Tondreau T等[10]发现未诱的的MSC也可以表达神经特异标记物,如Nestin和β微管蛋白Ⅲ,酪氨酸羟化酶等。Deng J[11]研究中也证实,体外培养大鼠的MSC具有自发表达早期的神经标记物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ),也有细胞表达成熟神经细胞的标记物,如神经微丝M(FNM),这些跟本实验对照组仍能诱导的MSC能表达NSE相一致。

我们的实验利用光感受器细胞上清液模拟视网膜体内发育的微环境诱导骨髓间充质干细胞成为视网膜光感受器样细胞,视网膜神经细胞培养上清液可能在骨髓间充质干细胞的存活与分化方面起重要作用。尽管BMSC向神经细胞分化的研究已获得了一些令人鼓舞的结果,但是还面对了许多待进一步解决的问题:(1)对于BMSC的鉴定一直都没有一个统一的说法,对BMSC的细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的进一步研究;(2)光感受器细胞在体外的外节容易脱落变性,如何进一步保持其完整性以及存活时间;(3)体外BMSC向视网膜样细胞诱导分化模式和分子调控机制还不甚清楚,其诱导的微环境还比较复杂,有的学者直接采用鸡尾酒式的加入好几种生长因子进行诱导,对于其中各生长因子具体作用以及相互间的作用仍不清楚;(4)对于本实验诱导出来表达视紫红质的MSC细胞的与真正的光感受器细胞之间不管是从形态上还是都有很大的差距,缩短这一差别,将MSC真正应用于眼科临床,还需进一步深入的研究探索。

参考文献:

[1] Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al.Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues[J].Transplantation, 1968,6(2):230-247.[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science, 1999,284(5411):143-147.[3] Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al.Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications[J].Stem Cells, 2001,19(3):180-192.[4] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neurosci Res, 2000,61(4):364-370.[5] Kicic A, Shen WY, Wilson AS, et al.Differentiation of marrow stromal cells into photoreceptors in the rat eye[J].J Neurosci, 2003,23(21):7742-7749.[6] Ullian EM, Sapperstein SK, Christopherson KS, et al.Control of synapse number by glia[J].Science, 2001,291(5504):657-661.[7] 谢茂松,徐国兴,李琼,等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较[J].国际眼科杂志, 2007,7(5):1285-1287.[8] Tomita M, Mori T, Maruyama K, et al.A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow-derived cells and retinal progenitor cells[J].Stem Cells, 2006,24(10):2270-2278.[9] 张枝桥, 董方田, 等.大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为光感受器样细胞的研究[J].中华眼科杂志, 2008,44(6):540-544.[10] Tondreau T, Lagneaux L, Dejeneffe M, et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation[J].Differentiation, 2004,72(7):319-326.[11] Deng J, Petersen BE, Steindler DA, et al.Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation[J].Stem Cells, 2006,24(4):1054-1064.

第三篇:在广西干细胞研究与临床应用学术研讨会开幕式上的致辞

在广西干细胞研究与临床应用学术研讨会

开幕式上的致辞

2011年5月21日

尊敬的吴祖泽院士、田增民院长、各位医学界的领导与专家:

大家上午好!

首先,请允许我代表广西壮族自治区卫生厅和本次会议的主办方对各位领导和专家在百忙之中前来出席此次会议表示热烈的欢迎和衷心的感谢!

众所周知,国民的健康状况是中华民族强盛、综合国力发展、社会繁荣与稳定最核心的要素之一。国务院《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006—2020年)》中提到,前沿技术的发展,特别是生物技术专项中提出的“基于干细胞的人体组织工程技术”的发展,是国家发展的重中之重。

2009年11月3日,温家宝总理在中国科学院成立60周年大会上发言时强调:“干细胞研究促进了再生医学的发展,这是继药物治疗、手术治疗之后的又一场医疗革命。这是一个重大机遇,我们不会再错失良机,这不是人类信仰的又一次盲动,所谓英雄所见略同是也。正因如此,作为生物干细胞技术不仅成为科学家们的研究热点,更成为资本市场的投资新宠,而且得到各国政府高度重视,以及对干细胞的政策支持!我们要力争在干细胞研究的更多领域取得领先地位。”同时,在国家863项目中,投入到干细胞与治疗性克隆、组织工程技术与产品研制、组织器官代用品研发等项目的研究经费达到近2亿元人民币。由此可见,我国在干细胞和组织工程领域的研究,已经被

1提高到了一个具有战略意义的高度。

干细胞与再生医学是当今世界生命科学的热点领域,已经成为继药物、手术治疗之后的新治疗模式。近年来,我区在干细胞研究应用方面取得一系列重大进展,在基础科学研究、应用技术开发、人才培养引进、创新平台建设、创新载体建设等方面取得了新的突破,为推动干细胞产业化发展奠定了基础。

干细胞移植作为先进的医疗手段,可以有效治疗糖尿病、缺血性心脏病、恶性血液疾病、遗传性疾病以及其他常规医疗手段难以应对的疾病。自体储存的干细胞使用方便,细胞活性强,无免疫排斥的危险,移植成活率高,治愈率高,医疗费用低。干细胞治疗的这些特点会为有需要的广大百姓带来福祉。其次,发展干细胞产业也是保护自治区民族基因资源的需要。广西是个多民族的自治区,生物资源丰富,基因资源的保护尤为重要。第三,自治区政府将生物医药作为战略性新兴产业,发展干细胞产业一方面可以提升广西在国内科研领域的地位,促进广西生物医药事业的发展,另一方面也可以充分发挥自治区丰富的动、植物资源优势,加快开发具有广西优势和特色的生物医药产品、保健药品以及日化用品等。干细胞产业化基地的建设既能创造巨大的经济效益,同时也有利于打造区域优势产业,形成区域经济核心竞争力。

我相信,通过本次学术交流,将进一步提高我区干细胞研究和临床应用的水平,使广大患者早日分享到高科技成果带来的好处。

祝大会圆满成功。

谢谢大家!

第四篇:PICC在临床护理中的应用

PICC在临床护理中的应用

外周静脉置入中心静脉导管(Peripherally Inserted Central Catheter PICC)是由外周静脉穿刺插管,其导管尖端定位于上腔静脉或锁骨下静脉。根据导管质量的不同可以在体内留置3个月~1年,操作快捷,无严重并发症。为患者开辟了一条方便,安全有效的静脉通路。能将各种药物直接输送到中心静脉处,能迅速稀释药物浓度,避免刺激性药物对血管的损伤。该项护理技术已被广泛应用于临床。PICC的临床应用

1.1危重患者的抢救与锁骨下静脉置管相比,PICC组导管留置时间长、并发症少的优点,并且PICC操作简单,可由护士单独执行操作,当医生进行其他抢救时,为病情重的患者的抢救赢得了时间[1]。

1.2用于烧伤患者大面积烧伤患者由于皮肤受损面积大,体液丢失多,休克期需补充大量液体,加之感染、修复期用药时间长,故静脉输液是治疗的重要途径之一。PICC为患者短时快速补液开辟了一条方便、安全的通路,减少了患者反复穿刺的痛苦[2]。

1.3胃肠外营养治疗及肿瘤患者化疗胃肠外营养对于危重患者的治疗具有的重要意义,是肠瘘,重症胰腺炎,短肠综合征等疾病的主要治疗手段的其中一种。而建立起一条有效的静脉通道是临床开展肠外营养的必要条件。PICC输注肠外营养是一种并发症少、有效、成功率高、安全的营养支持方法。PICC置管并发症的发生率明显低于锁骨下静脉置管和外周静脉穿刺[3]。

肿瘤患者经常需要长期静脉输注化疗药物及高浓度营养物质,临床传统的用药途径为反复浅静脉穿刺,这种方法不可避免地造成患者痛苦,化疗药物特殊的不良反应及对血管的破坏。由于PICC直达上腔静脉,药物注入后迅速被稀释,从而解除了药物对周围血管的损害,保护了上肢血管网,为肿瘤患者提供了一种无痛性的治疗通路[4]。

1.4 用于胸腹腔积液引流与化学治疗胸腹腔穿刺属于一种创伤性的治疗措施,适用于胸腔里面有大量的积液、大量腹水的患者,若一次性放水量过多、过快,会因胸、腹腔内压突然的降低,使血管扩张了,以及回心血量的减少,从而导致血压的下降,患者会发现有明显的不适,因此需要多次的进行胸腹腔穿刺放液才可以达到疗效。进行PICC置管引流胸腹腔积液,其优势就在于穿刺得危险性较小而且并发症少、并可多次的进行放液。刘杰等[5]在62例的恶性胸腔积液治疗过程中,应用PICC管进行胸腔留置引流化疗,除了其中1例出现了穿刺点红肿,胸腔内积液沿PICC管外渗外,其余的患者都没有发生并发症。廖少萍等[6]对其中43例顽固性腹水患者行PICC管长期留置引流,平均置管的时间达到20~30 d,没有1例出现过腹腔感染、低血压等的不良反应。PICC管在引流的过程中若有患者出现了不适的症状,可随时的调节速度或关闭其引流系统,不需要进行拔管,还可以随时的行腔内注射药物治疗,可以达到控制胸、腹腔积液的目的[7]。选择应用PICC管做胸腹腔引流,不仅可以有效的减少患者进行反复穿刺的痛苦,从而还避免了有发生交叉感染的症状[8]。

2PICC的置管方法

2.1静脉选择首选贵要静脉,因它管径粗,静脉瓣少,且在置管体位下为导管头端到中心静脉最短、最直的途径。其次选肘正中静脉、头静脉,尽量避免在头静脉穿刺。与头静脉相比较,贵要静脉置管成功率高、留管时间长[9]。

2.2置管要领送管中动作轻柔,送管遇到阻力不可强行置,可向后撤导管,轻微旋转或调整方向。穿刺了以后从回血帽观察回血状况,保持住穿刺针的位置,隔无菌巾松止血带,轻压穿刺点上方止血,撤出穿刺针、固定,用肝素盐水抽吸至见到有回血,然后连接好肝素帽以及密闭输液器。穿刺部位放小方纱,将覆盖无菌的透气膜固定好,以穿刺点为中心用弹力绷带加压包扎24h,穿刺第2d再换膜1次,以后每2~3d换膜1次。导管的护理

3.1 封管液的选择封管液的选择是保证PICC管道通畅比较关键的一环,除使用正压封管方法外,高浓度肝素封管液(25u/ml)较低浓度(12.5u/ml)堵管率低。对于不能使用肝素的疾病如血友病、血小板减少症、以及化疗的患者,都可以使用生理盐水进行封管,在封管之前需要用20ml的生理盐水进行冲管,然后再进行生理盐水的正压封管[10]。

3.2 带管回家的护理 PICC留管的时间长,许多化疗的患者在化疗期间歇期需要带管回家。患者带管出院后要注意①穿刺侧肢体后不可进行剧烈的运动,不可提重物品。②衣袖要穿宽松的。②每次洗澡之前用清洁塑料薄膜包裹好穿刺部位上下至少到10cm,以防止浸湿了局部。不能进行盆浴。洗完澡后要尽快用干毛巾把局部擦干。③平时的时候要每星期去医院进行封管两次。④如果发现敷料有污染或者是局部有红、肿、痛、渗出等异常的情况及时到医院去处理。

3.3 拔管的护理拔出导管时的动作要轻,帮助患者摆好体位,仔细的清掉敷料,皮肤进行常规消毒,在插管的地方抓住导管,与之皮肤至平行慢慢的拔出。拔完后把无菌纱布放置于针孔处,轻轻按压直到不出血为止,然后固定好胶布。观察拔出来的导管尖端是不是完整的、测量管长、并且比较插管时的长度。常见并发症的原因及处理

4.1机械性静脉炎机械性静脉炎常出现在穿刺后48~72 h。主要因选择的导管型号和血管的内径大小不适宜、导管材料过硬、穿刺侧肢体活动过度等所致,还包括患者缺乏维护导管的基本知识[11]。女性患者常见。对已发生机械性静脉炎患者,应抬高患肢,促进静脉回流,缓解症状,肿胀部位给以隔湿热敷或使用如意金黄散加绿茶茶水调制糊状外敷并配合紫苏叶代茶饮效果较好。半导体激光治疗仪(红外线)照射患处也可以预防性使用[12]。

4.2导管阻塞导管堵塞原因分血凝性导管堵塞和非血凝性导管堵塞。前者是由于血管壁受损或炎症、封管时机、方法不正确导致血液返流、在管腔内形成凝块或血栓所致;后者是导管管径选择不当,导管扭曲、打折、血流速度减慢、血液粘度异常者、药物沉淀所致。

为预防导管阻塞,根据血管粗细选择合适规格的导管尤为必要。穿刺过程中减少对血管内膜的损伤、选择20ml注射器正压脉冲式封管、输注粘稠度较高的液体时必须每6h用生理盐水冲管一次、对易于发生血栓的患者应用抗凝剂、置入后行胸片检查确认导管有无打折、盘绕或其他受损迹象亦是常采取的措施。如发生液体输入不畅,考虑末端孔顶到血管壁,回血抽不出,此时将导管外端转几圈,避开静脉壁。如血栓堵塞时,注入溶栓药物(尿激酶浓度5000IU/m1)保留20min[13]。

4.3感染感染的发生与无菌技术、不及时换药或免疫力低下有关。临床操作中应严格无菌操作技术;及时更换无菌贴膜,第一个24h内更换贴膜1次,以后更换贴膜1次/w。遵医嘱给予抗生素治疗及营养支持治疗,提高患者抵抗力[14]。

4.4 导管脱出其常见原因有:护士未能向患者及家属说明导管留置中的注意事项,患者随意活动过度造成脱管,护理巡视不到位,未能及时发现贴膜松动或有汗液、血液渗出使贴膜脱落而导致导管脱出。因此,置管后应向患者及家属说明导管留置中的注意事项,活动时采取保护性措施。及时观察贴膜情况,如有松动或有汗液、血液渗出需及时更换。导管一旦脱出不可再用。

4.5穿刺点渗血渗液发生原因常见于:渗血凝血机制异常、导管固定不当自由出入穿刺点频繁、穿刺位置选择不当、渗液纤维蛋白鞘生成、患者低蛋白血症期、输液管路不畅等。对前者应弹力绷带加压包扎,后者给予紫外线治疗仪照射,在15cm的距离使用,第1d5s,第2d 10s,第3d 15s,症状未完全缓解可重复照射,合并使用抗生素[15]。

第五篇:医学影像学在临床中的应用

医学影像学在临床中的应用

摘要:医学影像学在医学诊断领域是一门新兴的学科,不过目前在临床的应用上是非常广泛的,对疾病的诊断提供了很大的科学和直观的依据,可以更好的配合临床的症状、化验等方面,为最终准确诊断病情起到不可替代的作用;同时也很好的应用在治疗方面。现对X成像、CT成像、超声成像、核磁共振等基本原理、临床应用特点进行介绍。

关键字:医学影像学、X光成像(X-ray)、脑断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、超生成像(ultrasound)等

1895年德国的物理学家伦琴发现了X线,不久即被用于人体的疾病检查,并由此形成了放射诊断学。近30年来,CT、MRI、超声和核素显像设备在不断地改进核完善,检查技术核方法也在不断地创新,影像诊断已从单一依靠形态变化进行诊断发展成为集形态、功能、代谢改变为一体的综合诊断体系。与此同时,一些新的技术如心脏和脑的磁源成像和新的学科分支如分子影像学在不断涌现,影像诊断学的范畴仍在不断发展和扩大之中。1.X线成像

1.1 X线成像的基本原理

X线之所以能使人体组织在荧屏上或胶片上形成影像,一方面是基于X线的穿透性、荧光效应和感光效应;另一方面是基于人体组织之间有密度和厚度的差别。当X线透过人体不同组织结构时,被吸收的程度不同,所以到达荧屏或胶片上的X线量即有差异。这样,在荧屏或X线片上就形成明暗或黑白对比不同的影像。1.2 X线成像的特点

显示的结构层次比较丰富,有利于整体观察受检部位的组织结构,具有较高的空间分辨率,但其密度分辨率较低,无法区别组织密度差别小的结构。

1.3 X线成像在临床中的应用

X线成像是重要的临床诊断方法之一,是影像学的基础,已经积累了丰富成熟的经验,也是临床上使用最多的、最基本的诊断方法,特别是在骨骼、胸部、胃肠道应用广泛。2.CT成像

2.1 CT的成像基本原理

CT是用X线束对人体某部一定厚度的层面进行扫描,由探测器接收透过该层面的X线,转变为可见光后,由光电转换变为电信号,再经模拟/数字转换器转为数字,输入计算机处理。图像形成的处理有如对选定层面分成若干个体积相同的长方体,称之为体素。扫描所得信息经计算而获得每个体素的X线衰减系数或吸收系数,再排列成矩阵,即数字矩阵,数字矩阵可存贮于磁盘或光盘中。经数字/模拟转换器把数字矩阵中的每个数字转为由黑到白不等灰度的小方块,即象素,并按矩阵排列,即构成CT图像。所以,CT图像是重建图像。每个体素的X线吸收系数可以通过不同的数学方法算出。

2.2 CT的成像的特点

CT图像是由一定数目由黑到白不同灰度的象素按矩阵排列所构成。这些象素反映的是相应体素的X线吸收系数。不同CT装置所得图像的象素大小及数目不同。

CT图像是以不同的灰度来表示,反映器官和组织对X线的吸收程度。因此,与X线图像所示的黑白影像一样,黑影表示低吸收区,即低密度区,如含气体多的肺部;白影表示高吸收区,即高密度区,如骨骼。但是CT与X线图像相比,CT的密度分辨力高,即有高的密度分辨力。因此,人体软组织的密度差别虽小,吸收系数虽多接近于水,也能形成对比而成像。这是CT的突出优点。所以,CT可以更好地显示由软组织构成的器官,如脑、脊髓、纵隔、肺、肝、胆、胰以及盆部器官等,并在良好的解剖图像背景上显示出病变的影像。2.3 CT的成像在临床中的应用

CT由于它的特殊诊断价值,已广泛应用于临床。但CT设备比较昂贵,检查费用偏高,某些部位的检查,诊断价值,尤其是定性诊断,还有一定限度,所以不宜将CT检查视为常规诊断手段,应在了解其优势的基础上,合理的选择应用。3.核磁共振成像

3.1 核磁共振成像的基本原理

核磁共振成像技术是核磁共振在医学领域的应用。人体内含有非常丰富的水,不同的组织,水的含量也各不相同,如果能够探测到这些水的分布信息,就能够绘制出一幅比较完整的人体内部结构图像,核磁共振成像技术就是通过识别水分子中氢原子信号的分布来推测水分子在人体内的分布,进而探测人体内部结构的技术。3.2 核磁共振成像的特点

核磁共振成像技术是一种非介入探测技术,相对于X-射线透视技术和放射造影技术,MRI对人体没有辐射影响,相对于超声探测技术,核磁共振成像更加清晰,能够显示更多细节,此外相对于其他成像技术,核磁共振成像不仅仅能够显示有形的实体病变,而且还能够对脑、心、肝等功能性反应进行精确的判定。在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症等疾病的诊断方面,MRI技术都发挥了非常重要的作用。3.3 核磁共振成像在临床中应用

MRI所获得的图像非常清晰精细,大大提高了医生的诊断效率,避免了剖胸或剖腹探查诊断的手术。由于MRI不使用对人体有害的X射线和易引起过敏反应的造影剂,因此对人体没有损害。MRI可对人体各部位多角度、多平面成像,其分辨力高,能更客观更具体地显示人体内的解剖组织及相邻关系,对病灶能更好地进行定位定性。对全身各系统疾病的诊断,尤其是早期肿瘤的诊断有很大的价值。4.超声成像

4.1 超声成像的基本原理

阵列声场延时叠加成像是炒成成像中最传统,最简单的,也是目前实际当中应用最为广泛的成像方式。在这种方式中,通过对阵列的各个单元引入不同的延时,而后合成为一聚焦波束,以实现对声场各点的成像。4.2超声成像的特点

在临床应用方面,B超为最重要的诊断方法,B超可以清晰地显示各脏器及周围器官的各种断面像,由于图像富于实体感,接近于解剖的真实结构。4.3 超声成像的应用

随着医学超声成像技术的发展,从A型、M型一维超声成像、B型二维超声成像,发展到动态三维成像;由黑白灰阶超声成像发展到彩色血流成像;超声造影、谐波成像、多普勒组织成像等技术已经应用于临床。医学超声成像技术的发展和应用以其非电离辐射的独到之处、对软组织鉴别力较高的优势、仪器使用方便价格便宜的特点,成为医学成像中颇具生命力而不可代替的现代影像诊断技术。5.其他影像成像技术 5.1 放射性核素显像

将放射性药物引入体内后,以脏器内、外或正常组织与病变之间对放射性药物摄取的差别为基础,利用显像仪器获得脏器或病变的影像。常用的显像仪器为γ照相机和发射型计算机断层照相机(ECT),后者又分为正电子类型的 PECT 和单光子类型的SPECT。按显像的方式分为静态和动态显像两种。由于病变部位摄取放射性药物的量和速度与它们的血流量、功能状态、代谢率或受体密度等密切相关,因此所得影像不仅可以显示它们的位置和形态,更重要的是可以反映它们的上述种种状况(可以统称为功能状况),故实为一种功能性显像。众所周知,绝大多数疾病的早期,在形态结构发生变化之前,上述功能状态已有改变,因此放射性核素显像常常能比以显示形态结构为主的 XCT、MRI、超声检查等较早地发现和诊断很多疾病。但它的空间分辨率不如上述其他医学影像方法,清晰度较差,应根据需要适当选择或联合应用各种显像方法。

放射性核素检查的主要内容有:①心血管系统。主要有心肌显像和心功能测定。②神经系统。主要有局部脑血流(γCBF)断层显像、局部脑葡萄糖代谢显像和神经受体显像。③肿瘤显像。主要有放射免疫显像(RII)、其他特异性亲肿瘤显像、67Ga 显像、骨转移灶显像和淋巴显像。④消化系统。主要有肝血管瘤显像、肝胆显像、异位胃粘膜显像和活动性消化道出血显像。⑤呼吸系统。主要用于早期诊断发病2~3日内的肺栓塞。⑥泌尿系统。主要有泌尿系动态显像。利用 99mTc-DMSA 可以显示肾实质影像,能灵敏地发现肾脏瘢痕。此外,放射性核素显像还可用于内分泌系统、骨骼系统和血液系统疾病的诊断。5.2 数字减影血管造影技术

数字减影血管造影技术(Digital Subtraction Angiography,DSA)是一种新的X线成像系统,是常规血管造影术和电子计算机图像处理技术相结合的产物。普通血管造影图像具有很多的解剖结构信息,例如骨骼、肌肉、血管及含气腔隙等等,彼此相互重叠影响,若要想单纯对某一结构或组织进行细微观察就较为困难。

DSA的成像基本原理是将受检部位没有注入造影剂和注入造影剂后的血管造影X线荧光图像,分别经影像增强器增益后,再用高分辨率的电视摄像管扫描,将图像分割成许多的小方格,做成矩阵化,形成由小方格中的像素所组成的视频图像,经对数增幅和模/数转换为不同数值的数字,形成数字图像并分别存储起来,然后输入电子计算机处理并将两幅图像的数字信息相减,获得的不同数值的差值信号,再经对比度增强和数/模转换成普通的模拟信号,获得了去除骨骼、肌肉和其它软组织,只留下单纯血管影像的减影图像,通过显示器显示出来。

通过DSA处理的图像,使血管的影像更为清晰,在进行介入手术时更为安全。

5.3正子扫描(PET)

正电子发射型计算机断层显像(Positron Emission Computed Tomography),是核医学领域比较先进的临床检查影像技术。

其大致方法是,将某种物质,一般是生物生命代谢中必须的物质,如:葡萄糖、蛋白质、核酸、脂肪酸,标记上短寿命的放射性核素(如F18,碳11等),注入人体后,通过对于该物质在代谢中的聚集,来反映生命代谢活动的情况,从而达到诊断的目的。

最近各医院主要使用的物质是氟代脱氧葡萄糖,简称FDG。其机制是,人体不同组织的代谢状态不同,在高代谢的恶性肿瘤组织中葡萄糖代谢旺盛,聚集较多,这些特点能通过图像反映出来,从而可对病变进行诊断和分析。6.总结

医学影像学,以部位、功能为主线,综合讲述各部位正常人体各器官、组织的X线、CT、MRI表现,各种病变、疾病的X线、CT、MRI的表现与诊断。依不同的检查方法又可分成普通放射诊断学、CT诊断学、MR诊断学和介入放射学。

医学影像学是一门以各种成像设备(含X线摄影,超声显象,放射性核素,放射计算机断层摄影、电子计算机集X线体层摄影、核磁共振成像等)和放疗设备手段,应用基础医学和临床医学基本理论知识,对疾病进行医学影像诊断和放射治疗的学科。它具有自己的独立的理论体系,是自然科学、工程学、生物学、医学等多学科相互渗透和综合的新兴学科。7.参考文献 ① 部分内容摘抄自百度百科。② X线成像、超声成像、数字减影血管造影技等摘抄自课本P30-70,P163—173。

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